脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法及其裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域的植物轉基因技術領域，特別是涉及脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法及其裝置。
【背景技術】
[0002]轉基因技術作為生物技術的核心在植物改良、醫藥、畜牧業和食品工業方面都具有巨大的發展潛力。申請公布號為CN 104017825 A，名稱為離心沉降輔助植物轉基因的方法，公布了將植物受體材料與農桿菌混合后在合理的轉速下進行離心沉降處理，得到基因轉換液，并且將感染過的植物受體材料在選擇壓力下進行篩選，最終獲得陽性轉化子。離心沉降不僅可以增加受體材料的創傷面積，而且使農桿菌在離心力作用下深入到受體材料內部，顯著提高了植物轉基因效率。
[0003]然而以農桿菌轉化為主的植物轉基因技術目前存在轉化效率低下的問題，大部分植物的植株再生體系沒有建立起來，導致平均轉化率僅為1%左右，這個問題也成為了限制轉基因植物產業化的主要因素。利用傳統的農桿菌介導轉化時，被農桿菌侵染的外植物細胞主要分面在植物組織的表面，而大量的內部細胞缺乏與農桿菌接觸的機會。研究表明，農桿菌帶負電，將包含有目的基因的農桿菌置于電場中后，帶負電荷的農桿菌在電場強度下由負極向正極泳動，從而進入植物體內的各個組織器官中。由于細胞壁是以纖維絲為基質組成的，含有許多小孔，在電場作用下農桿菌迀移過程中可通過細胞壁的小孔，并進一步通過細胞膜而進入植物細胞。目前已有水稻玉米等植物的脈沖電泳轉基因報道，但這些報道中將DNA直接導入種子或離體組織、細胞，并沒有整合到受體植物的基因組中。
【發明內容】
[0004]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，本發明以植物植株為受體，并將含有目的基因的農桿菌導入植物內部，極大地提高了基因轉化效率，并且縮短了實驗周期，具有一定的應用價值。
[0005]本發明所采用的技術方案是:一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，包括如下步驟:
步驟一、收集長勢良好、根系完整的受體植物苗備用；
步驟二、將包含有目的基因的農桿菌溶液在搖床上震蕩培養，使其OD值達到0.4-0.8；步驟三、步驟二得到的農桿菌溶液在3300-3800轉/分鐘的條件下離心1-3分鐘，然后用pH為5-5.4的MSO液體培養基重懸，最后往懸浮液中加入100-200μΜ的乙酰丁香酮，得到轉化溶液；
步驟四、把步驟一中準備好的帶根的受體植物苗插到步驟三中得到的轉化溶液中； 步驟五、接通電源開始電泳，電泳持續2-4小時；
步驟六、步驟五完成后將受體植物轉入MSO固體培養基中，25°C下暗培養2-3天，MSO培養基因為不添加植物激素的MS培養基； 步驟七、暗培養后的植株轉入添加固體基質的花盆中，并于人氣候室中誘導開花結實；步驟八、從步驟其中得到的植株種子中篩選純合的陽性轉化子，便可得到轉基因植物種子。
[0006]進一步地，受體植物在步驟五中進行電泳時，負極插入受體植物近根端的微管組織中，正極可分流出若干支路，分別插入受體植物上端的莖、葉脈和生長點組織中。
[0007]進一步地，步驟五中所述受體植物進行電泳時，其電壓為100-150毫伏。
[0008]進一步地，步驟五中所述受體植物為完整的植株，大田種植苗、溫室苗或試管苗均可。
[0009]—種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，連接在轉基因植株受體的根須部和莖葉部的兩端;轉基因植株受體置于包含有培養溶液的容器中；轉基因植株受體的根須頂部全部淹沒在培養溶液內；輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置包括微電泳儀和連接在其一端的直徑為0.8-1.5毫米的金屬管，金屬管中設為若干孔，為目的基因進入植物的通道，其插入植株受體的近根部位的維管中，并且其浸泡于培養溶液內；微電泳儀包括正極和負極，其正極通過一根總導線和若干根分流導線組成的正極導線連接在植株受體的葉、莖和生長點上，其負極通過負極導線穿過金屬管連接在培養溶液內根須部中間。本發明的輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，在現有的微電泳儀的基礎上，將其正極連接在轉基因植株受體的莖、葉等若干個生長點，將其負極通過負極導線連接在轉基因受體植株的根須部一側的培養溶液內，并且位于培養溶液位置處的負極導線外還套有金屬管，金屬管中設有孔道為目的基因進入植物部提供通道。
[0010]進一步地，微電泳儀的電壓為100-150毫伏，連接在其兩端的負極導線和正極導線為鉑絲或者銀絲，保證轉基因植株受體具有較高的轉換率以及轉換效率。
[0011]進一步地，莖葉部包括莖部和葉面，正極導線分別與莖部和葉面連接的若干根分流導線直接插入其對應的莖部或葉面，并且與莖部連接的分流導線數量不少于兩根，與葉面連接的分流導線的數量也不少于兩根，使得其具有更高的轉換率。
[0012]進一步地，正極導線的分流導線的數量與受體植物的莖部或葉面等生長點的數量保持一致，也就是說正極導線盡可能多分出一些來，確保轉基因植物整體被覆蓋到電場下，無死角，減小嵌合體出現的概率。與現有技術相比，本發明的有益效果是:一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法。將包含有目的基因的農桿菌置于電場中后，帶負電荷的農桿菌在電場強度下由負極向正極泳動，從而進入植物體內的各個組織器官中。由于細胞壁是以纖維絲為基質組成的，含有許多小孔，在電場作用下農桿菌迀移過程中可通過細胞壁的小孔，并進一步通過細胞膜而進入植物細胞。本發明所采用的方法，極大地提高了基因轉化效率，并且縮短了實驗周期，特別是對于那些沒有建立起再生體系的植物，具有一定的應用價值。
【附圖說明】
[0013]圖1為一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法的一個實施例的步驟五電泳時受體植物與電源的連接結構示意圖；
其中:1-容器，2-轉基因植株受體，21-根須部，22-莖葉部，23-莖部，24-葉面;3-微電泳儀，31-正極，32-負極，4-金屬管，41-孔，5-負極導線，6-正極導線，61-總導線，62-分流導線;7-培養溶液。
【具體實施方式】
[0014]為了加深對本發明的理解，下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明，該實施例僅用于解釋本發明，并不對本發明的保護范圍構成限定。
[0015]實施例一，以小蔓長春花植株為受體植株，轉換外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因
本實施例對小蔓長春花植株進行了脈沖電泳輔助轉基因試驗，被轉化的外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因。本實施例使用的小蔓長春花苗來自本實驗室。
[0016]本實施例包括如下步驟:
步驟一、從大田中采挖20棵健壯的小蔓長春花苗作為受體；
步驟二、將包含有幾丁質酶基因的農桿菌溶液在搖床上震蕩培養，使OD值達到0.6;步驟三、步驟二得到農桿菌溶液在3500轉/分鐘的條件下離心2分鐘，然后用pH為5.2的MSO液體培養基重懸，最后往懸浮液中加入200μΜ的乙酰丁香酮，得到轉化溶液；
步驟四、把帶根的受體植物苗插到轉化溶液中；
步驟五、接通電源開始電泳；
步驟六、2小時后，將受體植物轉入MSO固體培養基中，25 °C下暗培養2天；
步驟七、暗培養后的植株轉入添加固體基質的花盆中，并于人氣候室中誘導開花結實； 步驟八、從種子中篩選純合的陽性轉化子。
[0017]本實施例對20棵小蔓長春花植株進行了遺傳轉化，結果11棵苗中檢測到了幾丁質酶基因的存在，PCR和核酸雜交檢測的結果相吻合，并得到了純合的陽性種子。從初步的研究結果來看，整體轉化效率比較高。
[0018]實施例二，以蒙古韭為受體植株，轉換外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因本實施例對蒙古韭植株進行了脈沖電泳輔助轉基因試驗，被轉化的外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因。本實施例使用的蒙古韭苗來自本實驗室。
[0019]本實施例包括如下步驟:
步驟一、從大田中采挖35棵健壯的蒙古韭苗作為受體；
步驟二、將包含有幾丁質酶基因的農桿菌溶液在搖床上震蕩培養，使OD值達到0.4;步驟三、步驟二得到農桿菌溶液在3400轉/分鐘的條件下離心1.5分鐘，然后用pH為5.1的MSO液體培養基重懸，最后往懸浮液中加入160μΜ的乙酰丁香酮，得到轉化溶液；
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