一種高效的dc細胞xbp1基因敲除方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體的涉及一種高效的DC細胞XBP1基因敲除方法。
【背景技術】
[0002] 樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)對于激發和維持T細胞依賴的抗腫瘤免疫反應 至關重要。然而，腫瘤可通過削弱DC細胞功能從而逃避免疫系統的殺傷作用。有研究表明DC 細胞內的內質網壓力感受因子XBP1的激活導致DC細胞抗腫瘤免疫活性降低，最終導致腫瘤 的進展。XBP1可調控DC細胞內的脂質代謝，脂質過氧化反應的副產品可以激發DC細胞內三 酰甘油的生物合成反應，導致異常的脂質堆積，最終抑制DC的功能，不能有效激發出抗腫瘤 活性的T細胞。因此，若能有效抑制DC細胞內XBP1基因的表達，將為腫瘤的靶向治療提供有 效的途徑。
[0003] 目前抑制DC細胞內XBP 1基因的表達是采用傳統siRNA法對XBP 1基因進行抑制，但 是只能抑制大約50%的XBP1基因表達，抑制效率較低。因此，如果能找到一種新的抑制DC細 胞內XBP1基因表達方法將有重要的生物學和醫學意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種DC細胞中XBP1基因的敲除 方法，旨在解決DC細胞中由于XBP1基因的存在并被激活而導致DC細胞抗腫瘤免疫活性降低 的不利現象。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明提供了一種DC細胞XBP1基因敲除方法。本發明實 施例DC細胞XBP1基因敲除方法包括如下步驟：
[0006] 以內質網壓力感受因子XBP1為靶基因進行CRISPR靶向序列設計，并根據所述 CRISPR靶向序列設計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
[0007] 將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進行退火反應處理形成雙鏈寡核 苷酸；
[0008] 酶切pCas9/gRNAl載體獲得線性化載體；
[0009] 將所述雙鏈寡核苷酸與所述線性化載體在連接反應體系中進行連接反應處理，獲 得連接產物；
[0010] 將所述連接產物轉化感受態細胞，并將被轉化后的細胞進行擴大培養后進行質粒 提取處理，獲得pCas9/gRNAl -XBP1質粒；
[0011]與現有技術相比，本發明DC細胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系 統，以XBP1為靶基因進行CRISPR靶向序列設計并制備出pCas9/gRNAl-XBPl質粒，使其對DC 細胞進行轉染，從而能高效的敲除DC細胞內的XBP1基因，從而有效保證了DC細胞的免疫刺 激作用，有效發揮了 DC細胞抗腫瘤免疫作用。
[0012] 進一步地，通過向轉染培養體系中還加入L189試劑，該L189試劑能夠與CRISPR/ pCas9基因敲除系統發揮增效作用，顯著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系統敲 除XBP1基因的效率。
【附圖說明】
[0013]圖1為改進CRISPR/Cas9系統作用原理示意圖；
[0014] 圖2為pCAS9/gRNAl質粒載體圖譜；
[0015] 圖3為實施例2、3中NC-DC、XBP1 -DC和XBP1 /LI 89-DC三組DC細胞中XBP1基因的表達 水平柱狀圖；
[0016] 圖4為NC-DC-T、XBP1-DC-T和XBP1/L189-DC-T三種DC-T細胞對RB視網膜母細胞瘤 細胞的殺傷效率圖。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不 用于限定本發明。
[0018] 本發明實施例提供了一種高效的DC細胞XBP1基因敲除方法。在一實施例中，該本 發明實施例DC細胞XBP1基因敲除方法包括如下步驟：
[0019] 步驟S01.基因敲除靶點和寡核苷酸設計：以內質網壓力感受因子XBP1為靶基因進 行CRISPR靶向序列設計，并根據所述CRISPR靶向序列設計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷 酸序列；
[0020] 步驟S02.寡核苷酸退火反應處理:將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列 進行退火反應處理形成雙鏈寡核苷酸；
[0021 ]步驟S03.酶切線性化載體:酶切PCas9/gRNAl載體獲得線性化載體；
[0022]步驟S04.線性化載體與雙鏈寡核苷酸連接反應:將步驟S02中獲得的雙鏈寡核苷 酸與步驟S03中獲得的所述線性化載體在連接反應體系中進行連接反應處理，獲得連接產 物；
[0023]步驟S05.轉化感受態細胞:將步驟S04中獲得的所述連接產物轉化感受態細胞，并 將被轉化后的細胞進行擴大培養后進行質粒提取處理，獲得pCas9/gRNAl-XBPl質粒；
[0024] 步驟S06.DC細胞XBP1基因敲除：將所述pCas9/gRNAl-XBPl質粒對DC細胞進行轉染 培養處理。
[0025] 具體地，上述步驟S01中的CRISPR靶向序列設計是以基于CRISPR/pCas9基因敲除 系統。
[0026]其中，該CRISPR/pCas9基因敲除系統中的CRISPR指的是規律成簇的間隔短回文重 復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 〇CRISPR/Cas是在 大多數細菌和古細菌中發現的一種天然免疫系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。 CRISPR/Cas系統首先產生與靶標序列對應的RNA序列，與病毒或質粒的DNA進行互補作用， 然后引導Cas內切酶對互補的序列進行雙鏈切割。其中Cas基因家族中的Cas9廣泛地應用于 該系統中，它是一種天然存在的內切酶，具有兩個酶切活性結構域:HNH核酸酶結構域和 Ruv-Clike結構域，分別切割互補鏈和非互補鏈。切割過程需要另外兩個RNA的幫助，分別為 CRISPR RNA(crRNA)和反式CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA，tracrRNA)，人們已經 將這兩種RNA改造融合成一個向導RNA(single-guide RNA，sgRNA)，單個sgRNA足以幫助 Cas9實現定點切割的效果。
[0027] 經過人工改造的CRISPR/Cas系統一般分為兩種，一種主要由Cas9、tracrRNA和 crRNA三部分構成；另一種主要由Cas9和sgRNA兩部分構成。載體的構建過程簡便快捷，僅需 人工合成一段和靶標序列相同的序列，連接至載體特定位點即可，具有高通量高效率的特 點。
[0028] CRISPR/Cas9系統作用原理如圖1所示，其平臺是從化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系統優化而來，由SpCas9核酸酶和gRNA構成。其中SpCas9核酸酶識 別基因組中的PAM(Protospacer adjacent motif ,ΡΑΜ)序列，gRNA中的長約20bp的引導序 列決定革G向特異性。當基因組上位于PAM5'端的前體間隔序列(Protospacer)與gRNA中的引 導序列互補時，Cas9核酸酶啟動對DNA雙鏈進行切割，形成DNA雙鏈斷裂缺口（Double-strand breaks,DSBs)〇
[0029] DSBs能激活細胞內非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源 重組(Homology directed repair ,HDR)兩種DNA修復機制。NHEJ修復過程可以引入堿基的 隨機插入或者缺失（Insertion or deletion);而在外源模板存在的情況下，細胞也可以通 過HDR的方式對基因組進行精確修復。細胞內發生HDR的頻率比NHEJ低，只發生于細胞分裂 的S期和G2期，而NHEJ發生于整個細胞周期。HDR與NHEJ在細胞內同時存在，但在NHEJ存在缺 陷的細胞內HDR發生頻率更高，因此抑制NHEJ可提高HDR的發生頻率。
[0030] NHEJ包含兩種類型的途徑：（1 )DNA連接酶IV依賴性NHEJ(經典NHEJ，C-NHEJ)途徑， 主要用于末端連接；（2)選擇性NHEJ(a 1 t-NHEJ/A-NHEJ/A-EJ)途徑，需要DNA連接酶I/III， C-NHE J途徑缺失時可誘發。
[0031 ]因此，CRISPR/Cas9基因敲除系統的靶點由19個堿基構成。靶點前面為轉錄起始信 號G，靶點后面為PAM序列NGG。這樣可作為靶點的序列為GN20GG。基于此，上述步驟S01中是 以內質網壓力感受因子XBP1為革E1基因，通過在線軟件(http://crispr.mit. edu)針對XBP1 基因進行CRISPR靶向序列設計和脫靶位點預測。那么根據所述CRISPR靶向序列設計寡核苷 酸序列。
[0032] 在一實施例中，該過綜合分析最終選擇的CRISPR靶向序列如下述SEQ ID NO: 1中 下劃線所示：
[0033] "··.CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAA AGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAG CCCAGAGAGGGGC..."(SEQ ID NO：1)
[0034] 在進一步實施例中，根據所述CRISPR靶向序列設計的寡核苷酸序列包括正向寡核 苷酸序列和反向寡核苷酸序列，在一具體實施例中，所述正向寡核苷酸序列如下述SEQ ID NO: 2所示：
[0035] 5，GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT CCGTT3'（SEQ ID N0:2)
[0036] 反向寡核苷酸序列如下述SEQ ID N0:3所示：
[0037] 5 ' AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGT GTTTC3'（SEQ ID N0:3)
[0038] 上述步驟S02中的退火反應處