驟四、把帶根的受體植物苗插到轉化溶液中；
步驟五、接通電源開始電泳；
步驟六、3小時后，將受體植物轉入MSO固體培養基中，25 °C下暗培養3天；
步驟七、暗培養后的植株轉入添加固體基質的花盆中，并于人氣候室中誘導開花結實； 步驟八、從種子中篩選純合的陽性轉化子。
[0020]本實施例對30棵蒙古韭植株進行了遺傳轉化，結果23棵苗中檢測到了幾丁質酶基因的存在，PCR和核酸雜交檢測的結果相吻合，并得到了純合的陽性種子。從初步的研究結果來看，整體轉化效率比較高。
[0021]實施例三，以白術為受體植株，轉換外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因本實施例對白術植株進行了脈沖電泳輔助轉基因試驗，被轉化的外源基因為來自煙草的幾丁質酶基因。本實施例使用的白術苗來自本實驗室。
[0022]本實施例包括如下步驟:
步驟一、從大田中采挖30棵健壯的白術苗作為受體；
步驟二、將包含有幾丁質酶基因的農桿菌溶液在搖床上震蕩培養，使OD值達到0.8;步驟三、步驟二得到農桿菌溶液在3800轉/分鐘的條件下離心3分鐘，然后用pH為5.4的MSO液體培養基重懸，最后往懸浮液中加入190μΜ的乙酰丁香酮，得到轉化溶液；
步驟四、把帶根的受體植物苗插到轉化溶液中；
步驟五、接通電源開始電泳；
步驟六、4小時后，將受體植物轉入MSO固體培養基中，25 °C下暗培養2.5天；
步驟七、暗培養后的植株轉入添加固體基質的花盆中，并于人氣候室中誘導開花結實； 步驟八、從種子中篩選純合的陽性轉化子。
[0023]本實施例對30棵白術植株進行了遺傳轉化，結果21棵苗中檢測到了幾丁質酶基因的存在，PCR和核酸雜交檢測的結果相吻合，并得到了純合的陽性種子。從初步的研究結果來看，整體轉化效率比較高。
[0024]實施例四
一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，連接在轉基因植株受體2的根須部21和莖葉部23的兩端;轉基因植株受體2置于包含有培養溶液7的容器I中；轉基因植株受體2的根須頂部全部淹沒在培養溶液7內；輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置包括微電泳儀3和連接在其一端的直徑為0.8-1.5毫米的金屬管4，金屬管4為目的基因通道，金屬管4中設有若干孔，為目的基因進入植物的通道，其插入植株受體的近根部位的維管中；微電泳儀3包括正極31和負極32，其正極31通過一根總導線61和若干根分流導線62組成的正極導線6連接在植株受體2的葉、莖和生長點上，其負極32通過負極導線5穿過金屬管4連接在培養溶液7內根須部21中間。本發明的輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，在現有的微電泳儀的基礎上，將其正極31連接在轉基因植株受體2的莖、葉等若干個生長點，將其負極32通過負極導線5連接在轉基因受體植株的根須部21—側的培養溶液7內，并且位于培養溶液7位置處的負極導線5外還套有金屬管4，金屬管4為目的基因提供通道。
[0025]在上述實施例中，微電泳儀3的電壓為100-150毫伏，連接在其兩端的負極導線5和正極導線6為鉑絲或者銀絲，保證轉基因植株受體具有較高的轉換率以及轉換效率。
[0026]在上述實施例中，莖葉部22包括莖部23和葉面24，正極導線6分別與莖部23和葉面24連接的若干根分流導線62直接插入其對應的莖部23或葉面24，并且與莖部23連接的分流導線62數量不少于兩根，與葉面24連接的分流導線62的數量也不少于兩根，使得其具有更高的轉換率。此外，正極導線6的分流導線62的數量與受體植物的莖部23或葉面24等生長點的數量保持一致，也就是說正極導線6盡可能多分出一些來，確保轉基因植物整體被覆蓋到電場下，無死角，減小嵌合體出現的概率。另外，金屬管4用注射針頭代替，也可以實現同樣的轉換效果。
[0027]本發明的實施例公布的是較佳的實施例，但并不局限于此，本領域的普通技術人員，極易根據上述實施例，領會本發明的精神，并做出不同的引申和變化，但只要不脫離本發明的精神，都在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，其特征在于:包括如下步驟: 步驟一、收集長勢良好、根系完整的受體植物苗備用； 步驟二、將包含有目的基因的農桿菌溶液在搖床上震蕩培養，使其OD值達到0.4-0.8； 步驟三、步驟二得到的農桿菌溶液在3300-3800轉/分鐘的條件下離心1-3分鐘，然后用pH為5-5.4的MSO液體培養基重懸，最后往懸浮液中加入100-200μΜ的乙酰丁香酮，得到轉化溶液； 步驟四、把步驟一中準備好的帶根的受體植物苗插到步驟三中得到的轉化溶液中； 步驟五、接通電源開始電泳，電泳持續2-4小時； 步驟六、步驟五完成后將受體植物轉入MSO固體培養基中，23-27°C下暗培養2-3天，所述MSO培養基因為不添加植物激素的MS培養基； 步驟七、暗培養后的植株轉入添加固體基質的花盆中，并于人工氣候室中誘導開花結實； 步驟八、從步驟七中得到的植株種子中篩選純合的陽性轉化子，便可得到轉基因植物種子。2.根據權利要求1所述的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，其特征在于:所述受體植物在步驟五中進行電泳時，負極插入受體植物近根端的微管組織中，正極可分流出若干支路，分別插入受體植物上端的莖、葉脈和生長點組織中。3.根據權利要求1或2所述的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，其特征在于:所述受體植物在步驟五中進行電泳時，其電壓為100-150毫伏。4.根據權利要求1所述的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，其特征在于:所述受體植物為完整的植株，大田種植苗、溫室苗或試管苗均可。5.使用的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，其特征在于:連接在轉基因植株受體(2)的根須部(21)和莖葉部(23)的兩端;所述轉基因植株受體(2)置于包含有培養溶液(7)的容器(I)中；所述轉基因植株受體(2)的根須頂部全部淹沒在培養溶液(7)內； 所述輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置包括微電泳儀(3)和連接在其一端的直徑為0.8-1.5毫米的金屬管(4)，所述金屬管(4)為目的基因通道，其上設有若干通孔(41)，并且所述金屬管(4)插入植株受體(2)的根須部(21)位置的培養溶液(7)內； 所述微電泳儀(3)包括正極(31)和負極(32)，其正極(31)通過一根總導線(61)和若干根分流導線(62)組成的正極導線(6)連接在植株受體(2)的葉、莖和生長點上，其負極(32)通過負極導線(5)穿過金屬管(4)連接在培養溶液(7)內根須部(21)中間。6.根據權利要求5所述的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，其特征在于:所述微電泳儀(3)的電壓為100-150毫伏，根據權利要求5所述的脈沖電脈輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，其特征在于:所述受體植物的莖葉部(22)包括莖部(23)和葉面(24)，所述正極導線(6)分別與莖部(23)和葉面(24)連接的若干根分流導線(62)直接插入其對應的莖部(23)或葉面(24)，并且與莖部(23)連接的分流導線(62)數量不少于兩根，與葉面(24)連接的分流導線(62)的數量也不少于兩根，確保轉基因植物整體被覆蓋到電場下，無死角，減小嵌合體出現的概率。7.根據權利要求6所述的脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因裝置，其特征在于:所述正極導線(6)的分流導線(62)的數量與受體植物的莖部(23)或葉面(24)等生長點的數量保持一致。
【專利摘要】本發明公開了一種脈沖電泳輔助農桿菌介導的植物轉基因方法，將包含有目的基因的農桿菌置于電場中后，帶負電荷的農桿菌在電場強度下由負極向正極泳動，從而進入植物體內的各個組織器官中。由于細胞壁是以纖維絲為基質組成的，含有許多小孔，在電場作用下農桿菌遷移過程中可通過細胞壁的小孔，并進一步通過細胞膜而進入植物細胞。本發明所采用的方法，極大地提高了基因轉化效率，并且縮短了實驗周期，特別是對于那些沒有建立起再生體系的植物，具有一定的應用價值。
【IPC分類】A01H5/10, C12N15/84, C12M1/42
【公開號】CN105602986
【申請號】CN201610155430
【發明人】張邊江, 陳全戰, 唐寧
【申請人】南京曉莊學院
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月18日