一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納米載體及制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于復合材料技術領域，尤其涉及一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納米 載體及制備方法。
【背景技術】
[0002] 對于致殘及難以恢復的疾病，基因治療是一種的預防，治療及可能治愈這類疾病 的有前景的根本性革新手段。然而，基因治療的發展因細胞轉染及基因表達的技術不足而 被限制。然而，基因治療的發展因細胞轉染及基因表達的技術不足而被限制。
[0003] 克服基因轉染的屏障
[0004] 基因傳遞的最終目標是使基因材料安全及有效的到達靶細胞核。達到此目標因外 源基因到達細胞核的重重屏障而受阻，而使基因表達以治療或預防疾病又必須到達細胞 核。這類屏障包括載體胞外穩定性，體內分布，細胞的攝取及胞內入核的途徑。
[0005] 理想的載體性質
[0006] 為克服這些屏障，以介導安全有效的基因傳遞，基因載體需有以下性質：與基因結 合牢固及攜帶大量基因，保護基因，儲存及生物穩定性，靶向運輸，被細胞內化的能力及從 內涵體逃逸以釋放基因，胞內對于核的定向運輸及入核，足夠的停留時間使基因表達，無毒 性，無免疫原性，可生物降解及生物相容性。具有這些性質的載體目前還不存在，目前存在 的載體因其一些難以接受的副作用及不足夠的轉染效率而難以廣泛應用。
[0007] 當前載體的挑戰
[0008] 過去，病毒載體因其本身具備的轉染多種細胞的能力而成為一種主要的基因轉染 載體，但是，病毒載體的應用卻因為其制備復雜，低運載量，包括其致炎癥反應，具有免疫原 性，病毒重組，激活原癌基因及難以控制等潛在安全問題而受限。近期的研究主要專注于非 病毒載體，因其低毒，無免疫原性且合成步驟簡易，運載量大。但相比較于病毒載體，非病毒 載體仍有低轉染率及較低的基因表達效率等問題。
[0009] 非病毒載體包括陽離子脂質體，陽離子聚合物及無機材料以保護基因不被核酶降 解及促使基因被細胞攝取，然而這些方式均是非特異性的且載體會在胞外與蛋白結合而消 耗了基因。
[0010]陽離子脂質體及陽離子聚合物因其能與帶負電荷的細胞膜吸附進而被攝取而成 為主要研究的非病毒載體。但是，考慮到其毒性，這兩類載體在體內模型的基因表達量并不 令人滿意。陽離子脂質體亦因其不穩定性，免疫應答性及易被血流清除而應用進一步受限。 殼聚糖亦具有生物相容性，可降解性，易于合成，及可被帶電荷基團連接從而可以結合胞外 或胞內靶向配體。然而，目前的殼聚糖及其衍生物的轉染俠侶相比于病毒轉染效率仍很低。 新型納米顆粒載體例如碳納米管已被證明重現性好，且可制備出所需的不同粒徑及形狀的 顆粒，然而其低溶解性及潛在毒性限制了它的臨床應用。
[0011] 鈣磷鹽(CaP)作為基因載體
[0012] 鈣磷鹽具備許多能夠成為理想載體的特性。鈣磷鹽還是牙齒及骨骼最主要的成 分，因此其有高度生物相容性，且不會導致變態及炎癥反應。因帶負電荷的基因骨架與Ca2+ 電荷吸引作用，基因與鈣磷鹽有很高的親和性從而發生縮合及包裝。同時，也使得鈣磷鹽能 夠攜帶大段的基因調控序列以提高基因表達水平，并使鈣磷鹽基因復合物能穩定穿過次薄 膜。因鈣磷鹽在酸性條件下溶解，基因在內涵體中與CaP解離。鈣磷鹽可用于各種不同組織 并可通過連接配體實現靶向轉運。此外，其可通過簡單廉價的方式合成。因此，CaP納米顆粒 具有能夠克服多重基因運輸屏障的潛力。
[0013]盡管鈣磷鹽有上述多種優勢，但因其一些關鍵性缺陷限制了其成為基因載體:顆 粒不均一性，易沉淀，不穩定及分散性差。到目前為止，合成的鈣磷鹽因其對溫度，pH值，鈣 離子及磷酸根離子濃度，溶液攪拌速率及方式以及添加劑的加入的高度敏感性，其大小，新 裝，表面電荷及結晶性存在差異。如上所述，形態及理化性質對轉染及細胞攝取起到了關鍵 作用。顆粒的不均一性導致轉染效果不一致，并可使機體產生難以預測的后果，這將限制其 作為基因載體的應用。
[0014]快速沉淀法制備CaP
[0015 ]為了制備出形態及理化性質較均一的CaP納米，So ko 1 〇 va等人利用快速沉淀法制 備CaP納米，其所制備CaP納米穩定性好，重復性高，其課題組采用多種修飾方式，在多種細 胞系進行轉染，然而，其轉染率低于50%。
【發明內容】
[0016] 本發明旨在克服現有技術上述的不足，提供一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納 米載體及制備方法
[0017] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0018] 所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷鹽，所述鈣磷鹽(CaP)表面被聚乙 烯亞胺(PEI)修飾。
[0019] 所述鈣磷鹽基因載體粒徑為245-255nm，電荷在0.2-0.3mv，PDI為0.2-0.3。優 選地，所述鈣磷鹽基因載體粒徑為251.6nm，電荷在0.22mv，Η)Ι為0.211。
[0020] 所述鈣磷鹽基因載體的制備方法包括如下步驟：
[0021 ] (1)制備鈣磷鹽：制備濃度為6-6.5mM硝酸鈣溶液和濃度為3-4mM磷酸氫二銨溶 液，調整硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液的pH為9一9.2，將等體積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二 銨溶液混合，形成作為載體本體的鈣磷鹽溶液；
[0022] (2)聚乙烯亞胺修飾鈣磷鹽：向步驟（1)制備的鈣磷鹽溶液中加入體積濃度為 1.8-2.2mg/mL聚乙烯亞胺溶液，鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的體積比為(9一 11):1，振 蕩后即得鈣磷鹽基因載體懸浮液。
[0023]優選地，方法中，是將等體積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液用蠕動栗以34ml/ min的速度同速栗入容器以混合，所述硝酸鈣溶液濃度為6.25mM;所述磷酸氫二銨溶液濃度 為3.74mM;所述聚乙烯亞胺溶液體積濃度為2mg/mL;所述鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的 體積比為10:1。
[0024]所述CaP/PEI/DNA納米載體是由上述f丐磷鹽基因載體與質粒結合而成。
[0025]所述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為225-235nm，電荷在25-30mv，PDI為0.1-0.2。 優選地，所述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為233. lnm，電荷在27.7mv，Η)Ι為0.123。
[0026]所述CaP/PE I/DNA納米載體的制備方法是用與鈣磷鹽基因載體懸浮液等體積的水 將鈣磷鹽基因載體懸浮液稀釋，振蕩后加入體積濃度為0.8-1.2mg/mL的質粒溶液，稀釋后 的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質粒溶液的體積比為（34-38): 1，混勻后即得CaP/PEI/DNA納 米載體。優選地，方法中所述質粒溶液的體積濃度為lmg/mL;所述稀釋后的鈣磷鹽基因載體 懸浮液與質粒溶液的體積比為36:1。
[0027]下面對本發明作進一步說明：
[0028]本發明采用以Sokolova等人發明快速沉淀反應制備CaP為核心，該快速沉淀反應 將硝酸鈣、磷酸氫二銨及PEI用蠕動栗同速(34mL/min)栗入混勻;而本發明調整了硝酸鈣溶 液及磷酸氫二銨溶液的pH值，硝酸鈣溶液及磷酸氫二銨溶液混勻后形成CaP，再加入PEI，利 用電荷吸引原理與CaP結合，抑制CaP繼續結晶，同時控制了粒徑，提高轉染系統穩定性提高 并使其整體帶正電荷，與DNA結合后，轉染體系(CaP/PEI/DNA)的使用Nano zs90粒度分析儀 測試，粒徑為233. lnm，zeta電位為27.7mv。本發明制備的以CaP為核心的納米載體的轉染率 穩定高于50%的納米載體，已具備投入實際應用的可能。
【附圖說明】
[0029] 圖1是質粒與CaP/PEI結合實驗結果圖，圖中：1道:marker 2道p-EGFP-Nl 3道CaP/ PEI/DNA。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷鹽，所述鈣磷鹽表面被聚乙烯亞胺 修飾。所述鈣磷鹽基因載體粒徑為251.6nm，電荷在0.22mv，Η)Ι為0.211。
[0032] 實施例2
[0033]制備實施例1所述鈣磷鹽基因載體的制備方法包括如下步驟：
[0034] (1)制備鈣磷鹽:制備濃度為6.25mM硝酸鈣及3.74mM磷酸氫二銨溶液，采用用超純 水溶解，用〇. 1M氫氧化鈉溶液調整硝酸媽及磷酸氫二銨溶液pH為9一9.2，各取5ml pH調整 為9-9.2的6.25mM硝酸鈣及3.74mM磷酸氫二銨溶液，利用蠕動栗(34mL/min)同速栗入小燒 杯中，混合以形成作為載體本體的鈣磷鹽溶液，制備過程中用磁力攪拌器攪拌；
[0035] (2)聚乙烯亞胺修飾鈣磷鹽:待硝酸鈣及磷酸二氫銨溶液全部栗入小燒杯中，等待 5秒，加入體積濃度為2mg/mL聚乙烯亞胺溶液溶液，鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的體積比 為10:1，以終止CaP繼續結晶，充分振蕩30s。取一定量CaP/PEI，加入等體積超純水稀釋，充 分振蕩30s，振蕩后即得鈣磷鹽基因載體懸浮液。
[0036] 實施例3
[0037]所述CaP/PEI/DNA納米載體是由實施例1所述f丐磷鹽基因載體與質粒結合而成。所 述CaP/PEI/DNA納米載體粒徑為233. lnm，電荷在27.7mv，TOI為0.123。
[0038] 實施例4
[0039]制備實施例3所述CaP/PEI/DNA納米載體的制備方法是用與鈣磷鹽基因載體懸浮 液等體積的水將鈣磷鹽基因載體懸浮液稀釋，振蕩后加入體積濃度為lmg/mL的質粒溶液， 稀釋后的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質粒溶液的體積比為36:1，混勻后即得CaP/PEI/DNA納 米載體。
[0040]實施例5 PEI修飾CaP搭載質粒轉染實驗報告 [0041 ] 1、材料與方法
[0042] 材料
[0043] pEGFP-Nl質粒;pEGFP-N-XIAP質粒；293t細胞系；HeLa細胞系；5-8F細胞系）；6-10B 細胞系；質粒大量提取盒購自美國Qiagen公司;PBS緩沖液、DMEM高糖培基、0.2