5 %胰蛋白酶 購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；PEI (2.5kD，branched)購自Sigma公 司；四水硝酸鈣(分析純)購自國藥集團化工試劑有限公司；磷酸氫二銨(分析純)購自國藥 集團化工試劑有限公司；lip〇2000購自invitrogen公司;DAPI及MTT工作液均購自碧云天公 司。
[0044] 方法
[0045] 合成CaP/PEI/DNA納米載體
[0046] 使用快速沉淀法制備CaP，其方法為:制備濃度為6.25mM硝酸媽及3.74mM磷酸氫二 銨溶液，采用用超純水溶解，用0.1M氫氧化鈉溶液調整硝酸|丐及磷酸氫二銨溶液pH至9，各 取5ml pH調整為9的6 · 25mM硝酸鈣及3 · 74mM磷酸氫二銨溶液，利用蠕動栗（34ml/min)同速 栗入混合以形成CaP，制備過程中用磁力攪拌器攪拌。待硝酸鈣及磷酸二氫銨溶液全部栗入 小燒杯中，等待數秒，加入一定量濃度為2mg/ml PEI溶液(CaP :PEI體積比為10 :1)以終止 CaP繼續結晶，充分混勻30s。取一定量CaP/PEI，加入等體積超純水稀釋，充分混勻30s，即為 用于與載體結合的CaP/PEI懸浮液，加入一定量DNA(CaP/PEI:DNA體積比為36:1)與CaP/PEI 懸浮液充分混勻，即制備出用于轉染的CaP/PE I /DNA轉染液。
[0047] 納米載體的粒徑及電位
[0048] 1)取200ulCaP/PEI加入600ul超純水，超聲儀100%能量超聲5111丨11，）設置似11〇 zs90粒度分析儀的分散劑為水，檢測樣品粒徑及電位
[0049] 2)取200ulCaP/PEI/DNA加入600ul超純水，超聲儀70 %能量超聲5min，）設置Nano zs90粒度分析儀的分散劑為水，檢測樣品粒徑及電位
[0050] 質粒與CaP/PEI結合實驗
[0051 ] CaP/PEI/DNA懸浮液在4°C下以14000g離心15min，取5ul上清，加入lulDNA載樣液， 混勾后加樣，以lkb ladder為標志行電泳。
[0052]細胞培養及轉染
[0053]用于轉染的細胞系為:HeLa細胞系，293T細胞系，5-8F細胞系，6-10B細胞系。HeLa 細胞系及293T細胞系采用高糖DMEM培基加入10%胎牛血清，培養于37°C，5%C02的環境中； 5-8F細胞系及6-10B細胞系采用RPMI1640培養基加入10 %胎牛血清，培養于37°C，5%C02的 環境中。轉染前12h，消化生長到70-80 %匯合的細胞，種于24孔板，細胞量為2.5*104/孔，每 孔500ml相應細胞培基。
[0054] Lipo2000轉染過程：按照lipo2000說明書操作：0.8ugDNA溶于50ul無血清高糖 DMEM培基(HeLa及293T細胞系）或RPMI 1640培基（5-8F及6-10B細胞系），2ullipo2000溶于 50ul相應細胞系所需無血清培基，放置5min后，兩者充分混勻，放置25min。更換細胞培基為 500ml相應無血清培基，加入轉染液，充分混勻，轉染5h-6h，更換培基為相應含血清完全培 基，培養48h。
[0055] CaP/PEI/DNA轉染液轉染過程:載體攜帶pEGFP-Nl質粒，更換細胞培基為500ml相 應無血清培基，每孔加入40ul按上述方法制備的CaP/PEI/DNA轉染液，充分混勻，轉染7h，更 換培基為相應含血清完全培基，培養48h。
[0056] DAPI復染細胞核
[0057] 確認培養細胞有表達之后，吸取每孔的培養基后以PBS每次lml漂洗3次，每孔加入 4%多聚甲醛lml，固定15min。避光吸取3u 1 DAPI原液，加入6ml去離子水中，吹打均勻。避光 備用。以PBS漂洗3次洗去多聚甲醛后，每孔加入200ul5mg/mlDAPI，孵育4min后，PBS漂洗3次 后，每孔再加500ulPBS后于熒光顯微鏡下觀察細胞轉染率。
[0058] MTT細胞毒性實驗
[0059] 將HeLa細胞，293T細胞，5-8F細胞，6-10B細胞分別消化，接種于96孔板，每孔 100ul，細胞量10000/孔，培養12h，更換為無血清培基，每孔加入10ulCaP/PEI/DNA轉染液， 轉染7h后，更換為完全培基，繼續培養48h，吸去舊培基，每孔加入200ulPBS漂洗3遍后，重新 加入180ul 1%FBS培基，再加入20ul 5mg/ml MTT液，充分混勻，避光培養4h。設置調零孔及 不加轉染液對照孔。吸去含MTT的培基，再加入lOOulDMSO,避光在搖床上50rpm 8min。將96 孔板置于酶標儀上，設置主波長490nm，參考波長633nm讀板。調零后，按照自身吸光值與對 照孔吸光值的比值計算每個處理孔的細胞生存率。
[0060]納米載體攜帶治療基因轉染
[0061 ] 按上述方法制備CaP/PEI/pEGFP-Nl-XIAP，在HeLa細胞系進行轉染，方法同上。
[0062] 2、結果
[0063] 納米載體的粒徑及電位見表1
[0064] 表 1
[0065]
[0066] 如表1所示，CaP/PEI粒徑均值為251.6nm，PDI為0.211，表明顆粒粒徑均一，無明顯 團聚，但其電位僅為0.22mv，為不穩定體系，放置數小時后可看到明顯沉淀形成。CaP/PEI/ DNA粒徑均值為233. lnm，PDI為0.123,表明加入質粒后可以進一步壓縮顆粒，使其粒徑減 小，且電位上升至27.7mV，體系穩定，放置數日仍無明顯沉淀生成，這說明正點位的PEI鏈條 可穿過DNA層或部分PEI重新分不到顆粒的表明使得顆粒整體正電位上升。
[0067] 質粒與CaP/PEI結合實驗
[0068]質粒結合實驗結果如圖1所示，表明CaP/TOI與DNA結合緊密，可攜帶質粒用于轉 染。
[0069]細胞轉染結果及MTT毒性實驗見表2
[0070]表 2
[0071]
[0072] CaP/PEI/DNA在各細胞系轉染率雖稍低于Lip〇2000轉染液，然而其細胞毒性顯著 小于Lipo2000轉染液。
[0073]攜帶治療基因載體轉染結果見表3
[0074] 表 3
[0075]
[0076]攜帶治療基因后載體轉染率并無明顯下降，提示該載體具有攜帶大片段基因能 力，可應用于基因治療。
【主權項】
1. 一種鈣磷鹽基因載體，其特征在于，所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷 鹽，所述鈣磷鹽表面被聚乙烯亞胺修飾。2. 如權利要求1所述的鈣磷鹽基因載體，其特征在于，所述鈣磷鹽基因載體粒徑為 245-255nm，電荷在0 · 2-0 · 3mv，PDI 為0 · 2-0 · 3 〇3. 如權利要求2所述的鈣磷鹽基因載體，其特征在于，所述鈣磷鹽基因載體粒徑為 251.6歷，電荷在0.2211^，？01為0.211 〇4. 一種CaP/PEI/DNA納米載體，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA納米載體是由權利要求1 至3任一項所述鈣磷鹽基因載體與質粒結合而成。5. 如權利要求4所述的CaP/PEI/DNA納米載體，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA納米載體 粒徑為 225-235nm，電荷在 25-30mv，PDI 為0.1 -0.2〇6. 如權利要求5所述的CaP/PEI/DNA納米載體，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA納米載體 粒徑為 233.1nm，電荷在 27.7mv，PDI 為 0.123〇7. 如權利要求1至3任一項所述鈣磷鹽基因載體的制備方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟： (1) 制備媽磷鹽:制備濃度為6-6.5mM硝酸媽溶液和濃度為3-4mM磷酸氫二銨溶液，調 整硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液的pH為9 一9.2，將等體積的硝酸|丐溶液和磷酸氫二銨溶液 混合，形成作為載體本體的鈣磷鹽溶液； (2) 聚乙烯亞胺修飾鈣磷鹽：向步驟（1)制備的鈣磷鹽溶液中加入體積濃度為1.8- 2.2mg/mL聚乙烯亞胺溶液，鈣磷鹽溶液與聚乙烯亞胺溶液的體積比為(9 一 11):1，振蕩后即 得鈣磷鹽基因載體懸浮液。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述硝酸鈣溶液濃度為6.25mM;所述磷酸氫 二銨溶液濃度為3.74mM;所述聚乙烯亞胺溶液體積濃度為2mg/mL;所述鈣磷鹽溶液與聚乙 烯亞胺溶液的體積比為10:1;所述將等體積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液混合是將等體 積的硝酸鈣溶液和磷酸氫二銨溶液用蠕動栗以34ml/min的速度同速栗入容器以混合。9. 如權利要求4至6任一項所述CaP/PEI/DNA納米載體的制備方法，其特征在于，所述方 法是用與鈣磷鹽基因載體懸浮液等體積的水將鈣磷鹽基因載體懸浮液稀釋，振蕩后加入體 積濃度為〇. 8-1.2mg/mL的質粒溶液，稀釋后的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質粒溶液的體積 比為(34-38): 1，混勻后即得CaP/PEI/DNA納米載體。10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述質粒溶液的體積濃度為lmg/mL;所述稀 釋后的鈣磷鹽基因載體懸浮液與質粒溶液的體積比為36:1。
【專利摘要】本發明公開了一種鈣磷鹽基因載體、CaP/PEI/DNA納米載體及制備方法。所述鈣磷鹽基因載體包括作為載體本體的鈣磷鹽，所述鈣磷鹽表面被聚乙烯亞胺修飾。所述CaP/PEI/DNA納米載體是由權利要求1至3任一項所述鈣磷鹽基因載體與質粒結合而成。本發明制備的以CaP為核心的納米載體的轉染率穩定高于50％的納米載體，已具備投入實際應用的可能。
【IPC分類】C12N15/68, C12N15/64, C12N15/87, C12N15/85
【公開號】CN105602988
【申請號】CN201610036614
【發明人】孫虹, 強清芬, 王風君, 張燕妮, 吳學文, 徐震航
【申請人】中南大學湘雅醫院
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月20日