一種用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的綠膿菌素培養基及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化妝品微生物安全檢測領域，具體涉及一種用于檢測化妝品中銅綠假 單胞菌的綠膿菌素培養基及方法。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在自然界中廣泛分布于水、空氣、土壤 和物體表面，也可見于正常人和動物的體表及腸道中，是環境的主要污染源之一，同時作為 一類對多種抗生素具有耐藥性的革蘭陰性桿菌，其可通過接觸破損的皮膚、黏膜感染人體， 是一種重要的條件致病菌，嚴重時可引發患者肺炎及敗血癥。近幾年來，化妝品日益成為人 們日常生活的必需品，化妝品中的營養物質(如蛋白質、油脂、維生素等)有利于銅綠假單胞 菌的生長和代謝，其代謝產物可分解化妝品的某些組分，引起產品腐敗變質，產生的綠膿毒 素可對使用者的皮膚產生刺激作用，甚至導致過敏或中毒，嚴重危害消費者的健康。因此 《化妝品衛生規范》（2007)、IS0 22717與EU76/78/768/EEC中規定銅綠假單胞菌不得檢出。 目前，我國對化妝品進行衛生學評價時，采用的是《化妝品衛生規范》(2007)中規定的方法， 該方法步驟較為繁瑣，檢測時間相對較長，雖然《化妝品安全技術規范》(2015)已正式發布， 將于2016年12月1日起實施，但其中對銅綠假單胞菌的檢測方法并沒有進行改良或簡化，因 此，為了提高檢測效率，保障產品質量及消費者的健康，尋找一種簡便、快速、有效的檢測方 法至關重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是為了克服現有技術中銅綠假單胞菌檢測方法步驟繁瑣、檢測時間 長的不足，提供一種用于簡便、快速且高效率的用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的綠膿菌 素培養基及方法。
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的綠膿菌素培 養基。
[0005] 本發明的綠膿菌素培養基每升含有卵磷脂0.8~1.2g、吐溫-80 6.0~8.0g、蛋白 胨18.0~20.0g、氯化鎂1.4~1.6g、硫酸鉀8.0~16.0g、三氯生(2,4,4'_三氯-2'-羥基二苯 醚)0.05~O.lg、明膠25.0~30.0g和瓊脂13.0~15.0g，余量為水，ρΗ6·9~7.1。
[0006] 所述的綠膿菌素培養基的制備方法:按所述的綠膿菌素培養基的組分含量，先將 卵磷脂和吐溫-80用蒸餾水加熱溶解，再加入蛋白胨、氯化鎂、硫酸鉀、三氯生（2,4,4'_三 氯-2 '-羥基二苯醚）、明膠和瓊脂，混勻，調pH值6.9~7.1; 121°C高壓滅菌20min。
[0007] 本發明的第二個目的是提供一種用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的方法。
[0008] 本發明的用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的方法，其特征在于，取化妝品樣品進 行增菌培養得到增菌培養液，然后將增菌培養液接入綠膿菌素培養基中培養，如果綠膿菌 素培養基上未長出菌落，則化妝品樣品中不含有銅綠假單胞菌;如果綠膿菌素培養基上長 出菌落，則將硫酸銨飽和水溶液滴加于所述的菌落上進行明膠液化試驗，明膠液化試驗呈 陽性則化妝品樣品中含有銅綠假單胞菌；所述的綠膿菌素培養基每升含有卵磷脂0.8~ 1.28、吐溫-80 6.0~8.(^、蛋白胨18.0~20.(^、氯化鎂1.4~1.68、硫酸鉀8.0~16.(^、三 氯生(2,4,4'_三氯-2'-羥基二苯醚)0.05~O.lg、明膠25.0~30.0g和瓊脂13.0~15.0g，余 量為水，PH6.9~7.1。
[0009] 優選，所述的將增菌培養液接入綠膿菌素培養基中培養是置于42±rc培養24h~ 48h〇
[0010] 優選，所述的取化妝品樣品進行增菌培養得到增菌培養液，當所述的化妝品樣品 是親水性的時，按lg化妝品樣品:9mLSCDLP增菌液的比例混勻，制備得到化妝品樣品備檢溶 液；當所述的化妝品樣品是疏水性的時，按lg化妝品樣品：8mL S⑶LP增菌液：lmL吐溫-80的 比例混勻，制備得到化妝品樣品備檢溶液;然后將化妝品樣品備檢溶液置于36°C±1°C恒溫 搖床250rpm增菌培養18h。
[0011] 優選，所述的方法還設置有與化妝品樣品備檢溶液等體積的空白對照液和陽性對 照液，所述的空白對照液為S⑶LP增菌液，所述的陽性對照液是按lmL 100~lOOOcf u/mL銅 綠假單胞菌液:9mL S⑶LP增菌液的比例混勻配制的。
[0012] 所述的銅綠假單胞菌為銅綠假單胞菌標準菌株ATCC9027。
[0013] 所述的將增菌培養液接入綠膿菌素培養基中培養是取100yL經增菌培養后的化妝 品樣品的增菌培養液加到培養皿中的綠膿菌素培養基上，涂勻，待凝固后再進行培養。
[0014] 本發明將化妝品樣品采用SCDLP增菌液進行增菌培養后，用綠膿菌素培養基直接 進行42°C生長試驗，對銅綠假單胞菌篩選檢測，觀察培養結果，如培養后出現菌落則進一步 結合明膠液化試驗鑒定。
[0015] 根據本發明的檢測方法，經過綠膿菌素培養基培養后，如果加空白對照或化妝品 樣品的增菌培養液的綠膿菌素培養基上均未能培養出銅綠假單胞菌的菌落，而加陽性對照 的增菌培養液的綠膿菌素培養基上培養出銅綠假單胞菌的菌落，則說明該化妝品樣品中不 存在銅綠假單胞菌;如果加空白對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上未能培養出銅綠假 單胞菌的菌落，而加化妝品樣品或陽性對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上均分別培養 出銅綠假單胞菌的菌落，且菌落較小，呈綠色或黃綠色，濕潤不透明，則對加化妝品樣品的 增菌培養液的綠膿菌素培養基上的菌落進一步進行明膠液化試驗進行檢測，如果將硫酸銨 飽和水溶液滴加于上述菌落10分鐘后，圍繞菌落出現一清晰帶，即為陽性，則說明化妝品樣 品中確實存在有銅綠假單胞菌。
[0016] 本發明同現有技術相比，具有以下有益效果：
[0017] (1)采用綠膿菌素培養基進行菌株篩選，其中綠膿菌素培養基配方中氯化鎂和硫 酸鉀為綠膿菌素顯色劑;三氯生(2,4,4'_三氯_2'_羥基二苯醚)為高效廣譜抗菌劑，對革蘭 氏陽性菌、陰性菌、酵母及病毒均有殺滅和抑制作用，而其對銅綠假單胞菌的最小抑制濃度 遠遠高于其它菌株;卵磷脂和吐溫-80為中和劑，可進一步中和待檢樣品中的防腐劑，提高 檢測靈敏度;培養基中加入明膠可為明膠液化試驗做準備，從而提高檢測效率。
[0018] (2)將接種后的綠膿菌素培養基放入42土 TC生化培養箱中培養，直接進行42°C生 長實驗，簡化了操作步驟，降低了分析成本，該方法可用于日常化妝品中銅綠假單胞菌的檢 測。
[0019] (3)在樣品制備中增加了空白對照液和陽性對照液，不僅可以檢驗所用的器具和 培養基是否完全滅菌及檢驗過程中是否遵守無菌操作程序，從而有利于發現操作中的問 題，而且可以陽性結果為參照，提高菌株的篩選效率，保證測定結果的準確性。
【具體實施方式】
[0020] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0021 ]以下實施例中所用的SCDLP增菌液每升含有:酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉 5g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、卵磷脂lg、吐溫-80 7g，余量為水，調pH為7.2。配制方法 是先將卵磷脂用蒸餾水加熱溶解后，再與其它成分混合，調pH值，121°C高壓滅菌20分鐘。 [0022]實施例1:爽膚水中銅綠假單胞菌的檢測方法
[0023]配制綠膿菌素培養基:先將卵磷脂1.2g和吐溫-80 6.0g用蒸餾水加熱溶解，再分 別加入蛋白胨20.0g、氯化鎂1.4g、硫酸鉀10.0g、三氯生（2，4，4 ' -三氯-2 ' -羥基二苯醚） 0 · 05g、明膠30 · 0g和瓊脂13 · 0g，加水至1L，攪拌混勻，調pH值6 · 9，121°C高壓滅菌20min。
[0024] 檢測方法：
[0025] (1)增菌培養:無菌稱取10g爽膚水加入到裝有90mL S⑶LP增菌液的玻璃瓶中，充 分混勻，制得化妝品樣品備檢液;將100mL SCDLP增菌液加入另一玻璃瓶中，制得空白對照 液;將10mL 100cfu/mL的銅綠假單胞菌標準菌株ATCC9027菌液加入到另一裝有90mLSCDLP 增菌液的玻璃瓶中，充分混勻，制得陽性對照液。將所制備的化妝品樣品備檢液、空白對照 液和陽性對照液分別置于36°C ± 1°C恒溫搖床250rpm增菌培養18h。
[0026] (2)綠膿菌素培養基培養:取經增菌培養后得到的化妝品樣品、空白對照或陽性對 照的增菌培養液各l〇〇yL分別加到平皿中的綠膿菌素培養基上，涂勻，待凝固后，置于42±1 °C恒溫生化培養箱培養48h，進行菌落計數。
[0027] 經過培養后，加空白對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上未能培養出銅綠假單 胞菌的菌落，而加化妝品樣品或陽性對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上分別培養出黃 綠色菌落，菌落較小，濕潤不透明。說明加化妝品樣品的增菌培養液的綠膿菌素培養基上有 銅綠假單胞菌可疑菌落。需要進一步用明膠液化試驗進行驗證。
[0028] (3)明膠液化試驗:將硫酸銨飽和水溶液滴加于加化妝品樣品的增菌培養液的綠 膿菌素培養基上的菌落，10分鐘后，圍繞菌落出現一清晰帶，即明膠液化試驗呈陽性。說明 化妝品樣品中確實存在銅綠假單胞菌。
[0029] 實施例2:洗面奶中銅綠假單胞菌的檢測方法
[0030] 配制綠膿菌素培養基:先將卵磷脂1. 〇g和吐溫-80 8.0g用蒸餾水加熱溶解，再分 別加入蛋白胨18.0g、氯化鎂1.6g、硫酸鉀8.0g、三氯生（2,4,4'-三氯-2'-羥基二苯醚） 0 · lg、明膠28 · 0g和瓊脂15 · 0g，加水至1L，攪拌混勻，