調pH值7 · 0，121°C高壓滅菌20min。
[0031 ]檢測方法：
[0032] (1)增菌培養:無菌稱取10g洗面奶加入到裝有90mL S⑶LP增菌液的玻璃瓶中，充 分混勻，制得化妝品樣品備檢液;將100mL SCDLP增菌液加入另一玻璃瓶中，制得空白對照 液;將10mL 400cfu/mL的銅綠假單胞菌標準菌株ATCC9027菌液加入到另一裝有90mL SCDLP 增菌液的玻璃瓶中，充分混勻，制得陽性對照液。將所制備的化妝品樣品備檢液、空白對照 液和陽性對照液分別置于36°C ± 1°C恒溫搖床250rpm增菌培養18h。
[0033] (2)綠膿菌素培養基培養:取經增菌培養后得到的化妝品樣品、空白對照或陽性對 照的增菌培養液液各l〇〇yL分別加到平皿中的綠膿菌素培養基上，涂勻，待凝固后，置于42 ± 1°C恒溫生化培養箱培養35h，進行菌落計數。
[0034] 經過培養后，加空白對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上未能培養出銅綠假單 胞菌的菌落，而加化妝品樣品或陽性對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上分別培養出綠 色菌落，菌落較小，濕潤不透明。說明加化妝品樣品的增菌培養液的綠膿菌素培養基上有銅 綠假單胞菌可疑菌落。需要進一步用明膠液化試驗進行驗證。
[0035] (3)明膠液化試驗，將硫酸銨飽和水溶液滴加于加化妝品樣品的增菌培養液的綠 膿菌素培養基上的菌落，10分鐘后，圍繞菌落出現一清晰帶，即明膠液化試驗呈陽性。說明 化妝品樣品中確實存在銅綠假單胞菌。
[0036 ]實施例3:粉底液中銅綠假單胞菌的檢測方法
[0037]配制綠膿菌素培養基:先將卵磷脂0.8g和吐溫-80 7.0g用蒸餾水加熱溶解，再分 別加入蛋白胨18.0g、氯化鎂1.4g、硫酸鉀12.0g、三氯生（2,4,4'_三氯-2'-羥基二苯醚） 0. lg、明膠25.0g和瓊脂13.0g，加水至1L，攪拌混勻，調pH值7.1，121°C高壓滅菌20min。 [0038]檢測方法：
[0039] (1)增菌培養:無菌稱取10g粉底液加入到裝有80mL SCDLP增菌液的玻璃瓶中，加 入10mL吐溫-80，充分混勻，制得化妝品樣品備檢液;將100mL S⑶LP增菌液加入另一玻璃瓶 中，制得空白對照液;將10mL 700cfu/mL銅綠假單胞菌標準菌株ATCC9027菌液加入到另一 裝有90mL SCDLP增菌液的玻璃瓶中，充分混勻，制得陽性對照液。將所制備的化妝品樣品備 檢液、空白對照液和陽性對照液分別置于36 °C ± 1°C恒溫搖床250rpm增菌培養18h。
[0040] (2)綠膿菌素培養基培養:取經增菌培養后得到的化妝品樣品、空白對照或陽性對 照的增菌培養液各l〇〇yL分別加到平皿中的綠膿菌素培養基上，涂勻，待凝固后，置于42±1 °C恒溫生化培養箱培養30h，進行菌落計數。
[0041 ]經過培養后，只有加陽性對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上可培養出銅綠假 單胞菌的菌落，而加化妝品樣品或空白對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上均未培養出 菌落，說明化妝品樣品中不存在銅綠假單胞菌。
[0042] 實施例4:面膜膏中銅綠假單胞菌的檢測方法
[0043] 配制綠膿菌素培養基:先將卵磷脂1.0g和吐溫-80 7.0g用蒸餾水加熱溶解，再分 別加入蛋白胨20.0g、氯化鎂1.4g、硫酸鉀16.0g、三氯生（2，4，4 ' -三氯-2 ' -羥基二苯醚） 0 · 05g、明膠30 · 0g和瓊脂14 · 0g，加水至1L，攪拌混勻，調pH值7 · 1，121°C高壓滅菌20min。
[0044] 檢測方法：
[0045] (1)增菌培養:無菌稱取10g面膜膏加入到裝有80mL SCDLP增菌液的玻璃瓶中，加 入10mL吐溫-80，充分混勻，制得化妝品樣品備檢液;將100mL S⑶LP增菌液加入另一玻璃瓶 中，制得空白對照液;將10mL lOOOcfu/mL的銅綠假單胞菌標準菌株ATCC9027菌液加入到另 一裝有90mL SCDLP增菌液的玻璃瓶中，充分混勻，制得陽性對照液。將所制備的化妝品樣品 備檢液、空白對照液和陽性對照液分別置于36 °C ± 1°C恒溫搖床250rpm增菌培養18h。
[0046] (2)綠膿菌素培養基培養:取經增菌培養后得到的化妝品樣品、空白對照或陽性對 照液各l〇〇yL分別加到平皿中的綠膿菌素培養基上，涂勻，待凝固后，置于42土 1°C恒溫生化 培養箱培養24h，進行菌落計數。
[0047]經過培養后，加空白對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上未能培養出銅綠假單 胞菌的菌落，而加化妝品樣品或陽性對照的增菌培養液的綠膿菌素培養基上分別培養出黃 綠色菌落，菌落較小，濕潤不透明。說明加化妝品樣品的增菌培養液的綠膿菌素培養基上有 銅綠假單胞菌可疑菌落。需要進一步用明膠液化試驗進行驗證。
[0048] (3)明膠液化試驗，將硫酸銨飽和水溶液滴加于加化妝品樣品的增菌培養液的綠 膿菌素培養基上的菌落，10分鐘后，圍繞菌落出現一清晰帶，即明膠液化試驗呈陽性。說明 化妝品樣品中確實存在銅綠假單胞菌。
[0049] 對比例1:實施例1-4所用的發明方法與《化妝品衛生規范》(2007)標準方法的比較
[0050] 為了驗證利用本發明方法檢測結果的正確性和可靠性，發明人將實施例1-4所取 的化妝品樣品在相同條件下各另取一份用《化妝品衛生規范》（2007)標準方法對其進行檢 測，具體檢測結果總結如表1。從表1可以看出，本發明方法僅需要用到2種培養基，檢測實驗 耗時僅為標準方法的一半或更短，而且檢測結果與標準方法的完全一致;本發明方法具有 操作簡單、節約成本、快速和準確性高的優點。
[0051] 表1本發明方法與標準方法檢測結果比較
【主權項】
1. 一種綠膿菌素培養基，其特征在于，每升含有卵磷脂0.8~1.2g、吐溫-80 6.0~8.(^、蛋白胨18.0~20.(^、氯化鎂1.4~1.68、硫酸鉀8.0~16.(^、2,4,4'-三氯-2'-羥基二 苯醚0.05~O.lg、明膠25.0~30.0g和瓊脂13.0~15.0g，余量為水，ρΗ6·9~7.1。2. -種權利要求1所述的綠膿菌素培養基的制備方法，其特征在于，按所述的綠膿菌素 培養基的組分含量，先將卵磷脂和吐溫-80用蒸餾水加熱溶解，再加入蛋白胨、氯化鎂、硫酸 鉀、2，4，4 三氯-2 羥基二苯醚、明膠和瓊脂，混勻，調pH值6.9~7.1。3. -種用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的方法，其特征在于，取化妝品樣品進行增菌 培養得到增菌培養液，然后將增菌培養液接入綠膿菌素培養基中培養，如果綠膿菌素培養 基上未長出菌落，則化妝品樣品中不含有銅綠假單胞菌;如果綠膿菌素培養基上長出菌落， 則將硫酸銨飽和水溶液滴加于所述的菌落上進行明膠液化試驗，明膠液化試驗呈陽性則化 妝品樣品中含有銅綠假單胞菌;所述的綠膿菌素培養基每升含有卵磷脂〇. 8~1.2g、吐溫-80 6.0~8.0g、蛋白胨18.0~20.0g、氯化鎂1.4~1.6g、硫酸鉀8.0~16.(^、2,4,4'-三氯_ 2'-羥基二苯醚0.05~O.lg、明膠25.0~30.0g和瓊脂13.0~15.0g，余量為水，ρΗ6·9~7.1。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的將增菌培養液接入綠膿菌素培養基 中培養是置于42 ± 1°C培養24h~48h。5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的取化妝品樣品進行增菌培養得到增 菌培養液，當所述的化妝品樣品是親水性的時，按lg化妝品樣品：9mL SCDLP增菌液的比例 混勻，制備得到化妝品樣品備檢溶液；當所述的化妝品樣品是疏水性的時，按lg化妝品樣 品：8mL S⑶LP增菌液:lmL吐溫-80的比例混勻，制備得到化妝品樣品備檢溶液;然后將化妝 品樣品備檢溶液置于36°C ± 1°C恒溫搖床250rpm增菌培養18h。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，還設置有與化妝品樣品備檢溶液等體積的 空白對照液和陽性對照液，所述的空白對照液為SCDLP增菌液，所述的陽性對照液是按 lmLIOO~1000cfu/mL銅綠假單胞菌液:9mL SO)LP增菌液的比例混勾配制的。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的銅綠假單胞菌為銅綠假單胞菌標準 菌株 ATCC9027。8. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的將增菌培養液接入綠膿菌素培養基 中培養是取1〇〇μL經增菌培養后的化妝品樣品的增菌培養液加到培養皿中的綠膿菌素培養 基上，涂勻，待凝固后再進行培養。
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測化妝品中銅綠假單胞菌的綠膿菌素培養基及方法。本發明的綠膿菌素培養基每升含有卵磷脂0.8～1.2g、吐溫-80？6.0～8.0g、蛋白胨18.0～20.0g、氯化鎂1.4～1.6g、硫酸鉀8.0～16.0g、三氯生(2,4,4ˊ-三氯-2ˊ-羥基二苯醚)0.05～0.1g、明膠25.0～30.0g和瓊脂13.0～15.0g，余量為水，pH6.9～7.1。本發明將化妝品樣品采用SCDLP增菌液進行增菌培養后，用綠膿菌素培養基直接進行42℃生長試驗，對銅綠假單胞菌篩選檢測，觀察篩選培養結果，如篩選培養后出現菌落則進一步結合明膠液化試驗鑒定。本發明簡化了銅綠假單胞菌檢測方法的操作步驟，提高了檢測效率，可用于日常化妝品中銅綠假單胞菌的檢測。
【IPC分類】C12Q1/04
【公開號】CN105603042
【申請號】CN201610192214
【發明人】文霞, 周少璐, 楊秀茳, 孫廷麗, 謝小保
【申請人】廣東省微生物研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月30日