基聯苯胺;所述終止 液為2.5N H2SO4。
[0040]其中，所述Di-TCTP蛋白抗原的制備方法包括如下步驟：
[0041 ] a、從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉錄成cDNA;
[0042] b、以cDNA為模板，進行PCR擴增，其中，PCR擴增的引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物如SEQ ID No.2所示;所述下游引物如SEQ ID No.3所示；
[0043] c、將PCR擴增得到的產物連接到表達載體，得重組表達質粒；
[0044] d、將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21中誘導表達，得融合蛋白，過柱純化后，即得 Di-TCTP蛋白抗原。
[0045] 進一步的，所述PCR擴增體系為：2XTaq PCRMasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下 游引物lyL，模板DNA lyL，ddH20 9.5yL;反應條件為：94°C預變性5min; 94°C變性35sec， 53.8°C 退火 35sec，72°C 延伸 35sec，35 個循環；最后 72°C 延伸 lOmin。
[0046] 所述表達載體為pET_28a( + )。
[0047] 本發明檢測犬惡絲蟲病的ELISA診斷試劑盒的檢測原理為：以純化的重組蛋白 (Di-TCTP蛋白）為抗原，將其包被ELISA板后，洗去游離部分;用3%牛血清蛋白封被，洗去游 離部分;再加入被檢血清，如果被檢血清是抗犬惡絲蟲血清，就能和抗原特異性結合，形成 免疫復合物，將游離的被檢血清洗去；加入酶標二抗(HRP標記的羊抗狗IgG)，就會形成Di-TCTP蛋白-抗犬惡絲蟲血清-酶標二抗復合物，洗去游離的酶標二抗;加入顯色物TMB(3，3， 5，5-Tetramethylbenzidine)，酶標二抗會使無色的顯色物出現顏色，加2 · 5N H2SO4終止;若 被檢血清不是抗犬惡絲蟲血清，則不能形成Di-TCTP蛋白-抗犬惡絲蟲血清-酶標二抗復合 物，酶標二抗不能被固定于ELISA板上，加入顯色物及終止液2.5N H2SO4后無色。
[0048] 本發明檢測血清中是否存在犬惡絲蟲的方法，包括如下步驟：
[0049] a、用Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板，過夜，再使用PBST徹底清洗四次；
[0050] b、將已包被的ELISA板用lOOyL的3%牛血清蛋白封被lh，再使用PBST徹底清洗四 次；
[0051 ] C、加入待測血清100yL到孔內，室溫處理lh，再加入HRP標記的羊抗狗IgG二抗反應 1 h后，使用PBST徹底清洗四次；
[0052] d、加入3,3'，5,5'_四甲基聯苯胺進行顯色；顯色反應由2.5N H2S〇4終止，在波長為 450nm的光波下讀取吸光度；
[0053] e、根據吸光度值判斷檢測結果。
[0054] 其中，a步驟所述的Di-TCTP蛋白抗原包被ELISA板的包被濃度為2.5yg/mL;c步驟 所述的HRP標記的羊抗狗IgG二抗稀釋度為1:5000。
[0055] 其中，d步驟所述的顯色時間為5~30min，優選顯色時間為10min。
[0056] e步驟所述的根據吸光度值判斷檢測結果，其判斷方法為:若吸光度值大于或等于 0.294，則血清中存在犬惡絲蟲，若吸光度值小于0.294，則血清中不存在犬惡絲蟲。
[0057] 下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限 制在所述的實施例范圍之中。
[0058]實施例1Di-TCTP蛋白抗原的制備 [0059] 1、RNA的提取以及cDNA的合成
[0060] 從犬惡絲蟲中提取得到RNA，并將其逆轉錄成cDNA;其中，犬惡絲蟲RNA提取根據 Qiagen 74104總RNA小量提取試劑盒說明書操作，按逆轉錄試劑盒(1:1161'1]1〇)操作步驟將1^^ 逆轉錄成cDNA。
[0061] 2、目的基因的擴增
[0062]以cDNA為模板，進行PCR擴增。
[0063]根據犬惡絲蟲腫瘤蛋白基因 Di-TCTP基因序列，設計片段擴增引物：
[0064] 上游引物為5 ' -GGATCCATGCTGATTTTCAAGG-3 '，包含一個BamHI的酶切位點（以下劃 線顯示）
[0065] 下游引物為5 ' -CTCGAGTCATTGTTTTTCTTC-3 '，包含一個XhoI的酶切位點（以下劃線 顯示）
[0066] PCR擴增體系為：2XTaq PCR MasterMix 12.5yL，上游引物lyL，下游引物lyL，模 板DNA lyL，ddH20 9.5yL;反應條件為：94°C預變性5min;94°C變性3586(：，53.8°(：退火 35sec，72°C 延伸 35sec，35 個循環;最后 72°C 延伸 lOmin。
[0067] 擴增得到的PCR產物，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行比對，然后經過Goldview染色， 凝膠成相系統觀察結果。
[0068] 3、重組表達質粒pET28a( + )-Di_TCTP的構建
[0069] (1)連接目的基因與pMD19-T載體的連接體系如表1所示。
[0070] 表 1
[0071]
[0072] (2)轉化將上述連接產物均勻緩慢的加入到30yL的DH5a感受態細胞中，冰浴 30min;然后再42°C水浴下熱激90sec。接下來再冰浴5min。最后每管中加入600yL的LB肉湯 培養基，在37°C水浴下震蕩培養lh到2h，使細菌復蘇;然后將菌液均勻涂布于含Amp的LB瓊 脂平板中，37°C恒溫箱中倒置培養過夜，挑培養好的菌落，按照質粒抽提試劑盒的說明書提 取犬惡絲蟲Di-TCTP的T克隆質粒。
[0073] (3)T克隆質粒的雙酶切
[0074] 提取的Τ克隆質粒用QuickCut酶進行雙酶切，體系如表2所述。
[0075] 表 2
[0077]將上述反應體系在37°C水浴2h，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查結果，然后回收酶切 產物。
[0078] (4)pET28a( + )質粒的提取與酶切
[0079] 按上述方法提取pET28a( + )表達載體質粒后，分別用QuickCut EcoRI與QuickCut Hindm進行雙酶切(酶切體系與反應條件同表2)。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回 收試劑盒回收酶切產物。
[0080] (5)酶切回收的D i -TCTP與pET28a (+)質粒的連接與轉化
[0081 ] 經雙酶切后的質粒和pET28a( + )質粒，在T4DNA連接酶作用下，37 °C連接lh，連接體 系見表3。
[0082]表 3
[0084]將產物轉入大腸桿菌DH5a感受態細胞，并鋪于含有Amp的平板中，并在37°C溫箱中 倒置培養過夜。第二天挑取數個單個獨立菌落進行菌落PCR的鑒定。
[0085] (6)重組表達質粒雙酶切鑒定
[0086] 將陽性的質粒進行提取。通過雙酶切鑒定是否含有目的片段，然后命名重組陽性 質粒為 pET28a( + )-Di-TCTP。
[0087] (7)重組表達質粒測序鑒定
[0088] 送英濰捷基（上海）貿易有限公司[Invi trogenTrading( Shanghai )Co ·，Ltd]進行 測序。測序選用正反雙向測序，對測序結果采用人工峰圖對比校對，重復測序三次，以保證 所測序列的準確性。測序結果表明，Di-TCTP和unigene ID 881有100%的相似性，該結果也 是試驗性地驗證了我們組裝的犬惡絲蟲轉錄組是個可信和強有力的挖掘犬惡絲蟲新基因 的工具。
[0089] 4、重組表達質粒的誘導表達及融合蛋白的獲得
[0090] 將重組表達質粒pET28a( + )-Di-TCTP的表達宿主菌BL21(DE3)菌落接入含有Amp (200yg/mL)的LB培養液中，37°C培養過夜。按照前述步驟進行誘導表達，獲得重組蛋白菌 液。
[0091] 上述表達菌液10,000r/min離心10min，留下菌體將上清棄去，然后置于-20°C 30min，反復凍融，已達到完全破除菌體細胞壁的作用。
[0092] 在菌體中加入20mL 20mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，重新懸浮沉淀，加入溶菌酶于菌 液中使其終濃度為lmg/mL，37°C振蕩30min后-20°C凍融過夜。
[0093] 超聲波破碎:200W，lmin/次，破碎20次，直到菌液澄清。
[0094] 10,000r/min 離心 15min，留上清備用。
[0095]將上清液進行親和層析，得到Di-TCTP蛋白抗原。
[0096]親和層析具體方法如下：
[0097] (1)金屬(Ni 2+)螯合瓊脂糖凝膠裝柱，柱床的體積為5mL;
[0098] (2)用緩沖液A平衡5-10個床體積，流速為lmL/min;
[0099] (3)將上清(20mmol磷酸鹽緩沖液），ρΗ 7·4,0·5Μ NaCl 0·45μπι濾膜過濾，流速為 lmL/min；
[0100] (4)用緩沖液A洗5-10個床體積，流速為lmL/min;
[0101] (5)用20、100、200、400mmo 1緩沖液B洗脫，2mL/min的流速，并收集各洗脫峰，通過 SDS-PAGE檢測重組蛋白的分子量大小和濃度；
[0102] (6)用超純