胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔10，〇〇〇個細胞接 種到12孔板，每孔體積為1 ml; ② 培養細胞:5% C02,37°C孵育24 h，至細胞單層鋪滿孔底； ③ 藥物處理:加入制備出的QSNQ(IC5Q: 1.26 μΜ)，處理不同時間（0,3,6，12,24 h); ④ 用PBS洗滌2次，加入 195 μL Annexin V-FITC結合液，再加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻； ⑤ 加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，輕輕混勾； ⑥ 室溫(20-25°C)避光孵育15分鐘； ⑦ (A)在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態及顏色的改變，綠色熒光為Annexin V-FITC染 色陽性細胞，紅色熒光為碘化丙啶陽性細胞。僅被綠色熒光染色，且體積較小的細胞為凋亡 細胞;被紅色或綠色和紅色雙染，且體積較大的細胞為壞死細胞;未被染色的細胞為正常細 胞。隨機觀察200個細胞，求得各種細胞所占的百分比，每個樣本計數3次取平均。（B)同時， 也利用流式細胞術方法檢測QSNQ對人肝癌細胞的凋亡。
[0023] 1、用QSNQ處理Hep3B細胞，檢測QSNQ對人肝癌Hep3B細胞的凋亡 采用上述實驗方法，得到的實驗結果見圖4A、圖4B、圖5A及圖5B，其中圖4A是用QSNQ處 理Hep3B細胞后，利用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況圖，shikonin和5-FU為陽性對照組；圖 4B是圖4A的定量分析圖。圖5A是用0SNQ處理Hep3B細胞后，利用流式細胞術檢測細胞凋亡 情況圖；圖5B是圖5A的定量分析圖。
[0024]結果分析 用0SNQ(終濃度為1.26 μΜ)處理人肝癌Hep3B細胞0、3、6、12、24 11后，進行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實驗，并在熒光顯微鏡觀察。從圖4B中可以看出，隨著藥物處理時間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強度也逐漸增強，其細胞凋亡程度也顯著增加。尤其當時間為24 h 時，細胞的熒光強度最高。結果說明，0SNQ可以有效誘導Hep3B細胞的凋亡，并呈時間依賴 性。
[0025]用0SNQ(終濃度為1.26 μΜ)處理人肝癌Hep3B細胞0、3、6、12、24 11后，進行4111^^111 V-FITC和PI進行標記，通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況。從圖5B中可以看出，隨著藥物處 理時間的不斷增加，肝癌Hep3B細胞凋亡的程度也隨之增加，尤其當藥物處理時間達到24 h 時，細胞的凋亡水平明顯增加。這一結果說明，0SNQ可以有效誘導Hep3B的凋亡，并呈時間依 賴性。
[0026] 2、用0SNQ處理HepG2細胞，檢測0SNQ對人肝癌HepG2細胞的凋亡 采用上述實驗方法，得到的實驗結果見圖6A及圖6B，其中圖6A是用0SNQ處理HepG2細 胞后，利用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況圖，hikonin和5-FU為陽性對照組；圖6B是6A圖的 定量分析圖。
[0027]結果分析 用0SNQ(終濃度為1.26 μΜ)處理人肝癌HepG2細胞0、3、6、12、24 11后，進行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實驗，并在熒光顯微鏡觀察。從圖6B中可以看出，隨著藥物處理時間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強度也逐漸增強，其細胞凋亡程度也顯著增加。尤其當時間為24 h 時，細胞的熒光強度最高。0SNQ可以有效誘導Η印G2細胞的凋亡，并呈時間依賴性。
[0028] 3、用0SNQ處理Huh7細胞，檢測0SNQ對人肝癌Huh7細胞的凋亡 采用上述實驗方法，得到的實驗結果見圖7A及圖7B，其中圖7A是用0SNQ處理Huh7細胞 后，利用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況圖，shikonin和5-FU為陽性對照組；圖7B是圖7A的定 量分析圖。
[0029]結果分析 用03購(終濃度為1.26以1〇處理人肝癌肋117細胞0、3、6、12、24 11后，進行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實驗，并在熒光顯微鏡觀察。從圖7B中可以看出，隨著藥物處理時間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強度也逐漸增強，其細胞凋亡程度也顯著增加。尤其當時間為24 h 時，細胞的熒光強度最高。0SNQ可以有效誘導Huh7細胞的凋亡，并呈時間依賴性。
[0030] 綜上所述，0SNQ(IC5Q: 1.26 μΜ)可以誘導人肝癌Hep3B、!fepG2和Huh7細胞的凋亡， 其癌細胞凋亡能力隨著時間的增加而逐漸升高。
【主權項】
1. 一種2-辛亞砜-1，4_萘醌的制備方法，具體按照以下步驟進行： (1) 2-辛巰基-1，4-萘醌的合成 在反應容器中加入1，4_萘醌和甲醇，甲醇的量滿足充分溶解1，4_萘醌即可，二者混合 均勻后加入1-辛硫醇，1-辛硫醇與1，4_萘醌的摩爾比為1.5:1，室溫下反應3-5小時后，向反 應容器中加入重鉻酸鈉和濃硫酸，重鉻酸鈉與1，4-萘醌的摩爾比為1:5,濃硫酸與1，4-萘醌 的摩爾比為3:4，繼續反應5-10分鐘;然后用二氯甲燒和飽和食鹽水萃取，無水硫酸鈉干燥， 過濾，濃縮至干燥，得2-辛巰基-1，4-萘醌； (2) 2-辛亞砜-1，4_萘醌的合成 在反應瓶中，加入步驟（1)產物2-辛巰基-1，4-萘醌和氯仿，氯仿的量滿足充分溶解2-辛巰基-1，4-萘醌即可，繼續加入3-氯過氧苯甲酸，3-氯過氧苯甲酸與2-辛巰基-1，4-萘醌 的摩爾比為1.2:1，0°C溫度下反應1.5-2.5小時，反應完全后加入5% NaHC03溶液中和反應 中過剩的3-氯過氧苯甲酸后終止反應;反應產物經二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，無水硫酸 鈉干燥，過濾，濃縮至干燥，得2-辛亞砜-1，4-萘醌。
【專利摘要】本發明公開了一種2-辛亞砜-1,4-萘醌的制備方法，解決了現有僅從植物中提取和分離萘醌類化合物遠遠不能滿足研究和應用需求的問題。具體方法是首先進行2-辛巰基-1,4-萘醌的合成，將1,4-萘醌與1-辛硫醇室溫下反應3-5小時后，加入重鉻酸鈉和濃硫酸，繼續反應5-10分鐘，產物后處理后得2-辛巰基-1,4-萘醌；然后進行2-辛亞砜-1,4-萘醌的合成，方法是將3-氯過氧苯甲酸與2-辛巰基-1,4-萘醌在0℃溫度下反應1.5-2.5小時，反應產物后處理后得2-辛亞砜-1,4-萘醌。本發明方法的合成路線簡單，反應溫度低，得到的2-辛亞砜-1,4-萘醌產物，抗癌效果明顯，而且對癌細胞的選擇性高。
【IPC分類】C07C315/02, C07C317/24, A61P35/00
【公開號】CN105646300
【申請號】
【發明人】金成浩, 申貴男, 羅英花, 臧延青, 孫虎男, 劉暢, 蔣雪園, 吳丹丹, 孟令旗, 王浩, 徐婉婷
【申請人】黑龍江八一農墾大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月25日