飽和度為 12。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，600MHz): H-1 (5 · 58，s)，H-3 (2.18，m)，H-3(1.96，m)，H-6(5.47，d，J = 6.0)，H-7(5.12，d，J = 6.0)，H-ll(6.92，s)，H-15 (6.74，d，J = 2.4)，H-16(7.58，d，J = 2.4)，H-17(2.45，s)，H-18(l.ll，s)，H-19(l.ll，s)，H-20(1.47，s)，l-0C0CH 3(1 ·91，s)，6-0⑶CH3(2· 14，s);核磁共振碳譜數據δ。(ppm，DMS〇-d6， 125MHz):91.7(CHa-C)，201.3(C，2-C)，43.7(CH2,3-C)，30.1(C，4-C)，99.7(C，5-C)，81.2 (CH，6-C)，79.6(CH，7-C)，128.6(C，8-C)，140.1(C，9-C)，46.4(C，10-C)，104.2(CH，11-C)， 155.3(C，12-C)，131.0(C，13-C)，131.9(C，14-C)，105.8(CH，15-C)，145.8(CH，16-C)，16.8 (CH3，17-C)，29.3(CH3，18-C)，24.2(CH3，19-C)，29.1(CH3,20-C)，171.1(Ca-0C0CH 3)，20.7 (CH3，1-OCOCH3)，172 · 8(C，6-OCOCH3)，21 · 9(CH3，6-OCOCH3);碳原子標記參見圖 1。紅外光譜 表明該化合物含有芳香碳(3012nm和1613nm)。咕NMR譜顯示4個甲基信號δΗΙ · 11 (H-18和!1-19)，1.47(!1-20)，2.45(!1-17)。兩個相互耦合的烯烴質子信號6!16.74(!1-15，(1，1 = 2.4)和 7.58 (Η-16，d，J = 2.4Hz)表明該化合物含有一個稠合呋喃環。13C NMR顯示24個碳信號，其中 包括6個芳香族碳信號δα〇4.2,128.6,131.0,131.9,140.1和155.3。這些數據表明，該化合 物為與呋喃環稠合的二萜類化合物。HMBC譜中，!1-110冊.92,8)與(：-120(：155.3)和(：-130 C131.0) ;H3-17(SH2.45，s)與C-8(SC128.6)，C-13(SC131·0)，C-14(SC131.9)和015(δ C105.8)的相關性驗證了苯環與呋喃環共輒這一推論。此外，C-l (SC91.7)和C-6 (SC81.2)與 相應的乙酰氧基0C171.1，δΗ1.91和δ(：172.8，δΗ2.14)的相關性表明C-1和C-6位各連有一 個乙酰氧基。HMBC譜中Η-7和C-5的相關性說明該化合物含有氧雜環丁烷部分。N0ESY譜中， Η-1和Η-6與Η3-20的相關性表明Η-1和Η-6為β-構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以 及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0040]實施例3:化合物(I)藥理作用試驗 [0041] -、材料和儀器
[0042]本實驗采用人腦惡性膠質母細胞瘤U251細胞株，購自美國模式菌種收集中心。 DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司;氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化氧、氫氧化鈉、磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、甲醇購自南京化工廠。化合物（I)自制，HPLC歸一化純度 大于98%。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亞諷(DMEM)購自美國Sigma公司;Aimexin-V/PI細 胞裯亡試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞裂解液、0 · 25%胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechst33258、細胞核染料DAPI、PMSF、Western blot凝膠配 制試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍染色液、標準蛋白、5X蛋白質變性緩沖液盒、 ECL超敏發光液、顯影定影試劑盒、X線膠片、硝酸纖維素膜、抗熒光淬滅封片液購自江蘇碧 云天生物研宄所。胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗體購自美國N0VUS 公司；兔抗人Hi stonH3抗體購自美國CST公司；山羊抗兔HRP二抗購自美國SantaCruz公司； 山羊抗兔焚光二抗購自美國EarthOx公司。
[0043] -20°C低溫冰箱(海爾青島），-80°C低溫冰箱(海爾青島），低溫冰箱(海爾青島），高 速離心機(飛鶴上海），培養皿/板(Coming美國），離心管(Coming美國），細胞培養箱(Thermo 美國），倒置顯微鏡(Olympus日本），熒光倒置相差顯微鏡(ZEISS德國），多用途恒溫水浴箱 (躍進上海），電子天平儀(上海機密科學儀器），超凈工作臺（ARITECH日本），微量移液器 (Dragon芬蘭），酶標儀(Bio-RAD德國），流式細胞儀(BDAccuriC6美國）。
[0044] 二、試驗方法
[0045] 1、細胞培養及傳代
[0046]人膠質母細胞瘤細胞系U251培養在含10%胎牛血清、1 %青霉素、1 %鏈霉素的 DMEM高糖培養基中，于37 °C，5 %C02培養箱中常規培養，每隔2天予更換新鮮培養基。待細胞 融合至80%左右后，吸除培養基，并用預熱的無菌磷酸酸鹽緩沖液洗3次，然后向培養皿中 加入含0.25%族蛋白酶及0.02%EDTA的細胞消化液lmL消化約2分鐘，光鏡下觀察細胞，可 見細胞逐漸回縮變圓，胞間間隙變寬，此時移除細胞消化液，加入完全培養基4mL終止消化， lmL槍頭輕柔吹打制成細胞懸液，低速離心機lOOOrpm離心5分鐘，吸除上清液，加入完全培 養基重懸，輕柔吹打均勻后，根據經驗按1:3~1:5傳代，傳代后的細胞置于培養箱中繼續 培，約每周傳代2次，以保持細胞處于對數生長期。細胞計數方法:細胞計數板擦拭干凈，并 將蓋玻片蓋在計數板上；將細胞懸液沿蓋玻片邊緣緩慢滴入計數板，光鏡下觀察，細胞透 明、折光性好為活細胞，計數4個大方格中的活細胞數。每細胞數=每個方格中活細胞數平 均值X稀釋倍數XI 〇4。
[0047] 2、CCK_8檢測細胞生存率
[0048] 取對數生長期的U251細胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化吹打細胞制成單細胞懸液 并計數，用完全培養基調整細胞濃度約2X104個/mL，將細胞接種于96孔培養板中，每孔100 yL，置于37°C、5%C02培養箱中培養12小時，吸除原培養基，按分組給予不同處理:空白對照 組(等量完全培養基），化合物（I)組設l、2、4mmol/L，每組設三個重復孔，無菌PBS封閉周邊 各孔，再次置于37 °C、5 %⑶滿養箱中，分別培養24、48、72小時后取出96孔板，吸除各組原 有培養基，更換為l〇〇yL DMEM培養液，本底組無細胞只有DMEM培養液。每孔加入10yL CCK-8 溶液，置于培養箱中繼續培養2小時。用全自動酶標儀測定每孔吸光度值(0D值），波長設定 在450mn處，取每組復孔的均值。上述實驗步驟重復3次，計算平均值。細胞生存率計算公式 如下：細胞生存率=(實驗組0D值-本底組0D值)/(對照組0D值-本底組0D值）X 100%，繪制 生長抑制曲線圖，并作統計學分析。
[0049] 3、Hoechst 33258染色
[0050] 實驗釆用碧云天公司H〇echst33258染色液，細胞發生凋亡時，會看到調亡細胞的 細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。根據細胞生存率結果，選取2mmol/L化合物（I)作 用48小時作為Hoechst 33258染色的條件。將細胞消化、離心、計數，調整細胞濃度后種入24 孔板中，置于37°C、5%C02培養箱中培養12小時，吸除原有培養基，按分組給予不同處理:空 白對照組(等量完全培養基），化合物（I)組設l、2、4mmol/L，無菌PBS封閉周邊各孔，再次置 于37 °C、5 % C02培養箱中，繼續培養48小時后取出24孔板，吸除各組原有培養基，無菌PBS洗 3次，每孔加入0.5mL多聚甲酸固定細胞15分鐘，PBS洗3次，各孔加入100yL Hoechst 33258 染色液，室溫黑暗環境下染色l〇min，去染色液，PBS搖床晃動沖洗3次，每次5分鐘，洗盡液 體，每孔滴加一滴抗熒光淬滅液，340nm波長的熒光顯微鏡下拍照并觀察細胞核形態學變 化。
[0051] 3、流式細胞術檢測細胞循亡
[0052]根據細胞生存率結果，選取48小時作為檢測細胞碉亡的特定時間點。取處于對數 生長期且狀態良好的U251細胞，按常規消化傳代，接種于6孔板內37°C、5 %⑶2培養箱中孵 育12h，按分組給予不同處理:空白對照組(等量完全培養基），化合物（I)組設l、2、4mmol/L， 置于37 °C、5 % C02培養箱中繼續培養4