8小時后，將原有培養液洗至5mL離心管中，PBS洗滌貼 壁細胞2次，加入含有EDTA的適量胰酶消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打 下來時，盡量吸盡胰酶細胞消化液。加入收集的原有細胞培養液，稍混勻，轉移到5mL離心管 內，lOOOg離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。取5萬個重懸的細胞， lOOOg離心5分鐘，棄上清，加入100yL AimexinV-FITC結合液輕輕重懸細胞。加2mL AnnexinV-FITC，輕輕混勾。室溫避光輝育10分鐘。lOOOg離心5分鐘，棄上清，加入2yL碘化丙 唆染色液，輕輕混勾，冰浴避光放置15min。隨即進行流式細胞儀檢測，AmexinV-FITC為綠色 熒光，PI為紅色熒光。記錄AnnexinV-FITC+PI+和AnnexinV-FITC+PI-作為凋亡細胞，每次計 數10000個細胞，計算各組凋亡率。
[0053] 4、統計學處理
[0054]采用SPSS 16.0進行統計學分析，實驗所有數據均代表3次重復實驗的結果，以均 數士標準差表示。生存率的組間比較采用析因設計資料的方差分析，細胞凋亡率的組間比 較釆用單因素方差分析，檢驗水準為& = 0.05，？〈0.05為有顯著性差異，？〈0.01為極有顯著 性差異。
[0055]三、結果及結論
[0056] 1、化合物（I)對U251細胞生存率的影響
[0057]化合物（I)抑制U251細胞存活生長CCK-8實驗結果顯示，不同濃度化合物（I)作用 U251細胞后，隨著作用濃度増高，作用時間加長，U251細胞生存率明顯下降，方差分析顯示 化合物（I)濃度因素的主效應？ = 945.8(?〈0.01);作用時間因素的主效應？ = 302.67(卩〈 0.01)，濃度、時間因素的交互作用？ = 45.7(?〈0.01)。結合表1，可發現化合物（1)對1]251細 胞生存率的抑制作用呈時間、劑量依賴性，即化合物（I)濃度越高，作用時間越長，其抑制作 用越強。通過計算得出化合物⑴作用24h、48h、7 2h的IC5Q值分別為，3.67mmo 1 /L、1.37mmo 1 / L、1 · 09mmol/L〇
[0058] 2、化合物（I)對U251細胞碉亡形態學的影響
[0059] 正常組及化合物（I)處理組細胞經H〇CheSt33258染色，熒光顯微鏡下觀察可見對 照組細胞核形態規則，且呈淡藍色均勻著色;而經2mmol/L化合物（I)處理48小時后，與對照 組相比，細胞核出現不同程度的固縮，顏色較為明亮，染色致密濃染，核碎裂明顯，且可見典 型的凋亡小體。以上細胞核形態學的改變提示化合物（I)有誘導U251細胞凋亡作用。
[0060] 3、化合物（I)對U251細胞凋亡率的影響
[0061 ] 對照組及各處理組經Annexin V-FITC/PI染色后行流式細胞術檢測，結果顯示:對 照組、lmmo 1 /L化合物（I)、2mmo 1 /L化合物（I)和4mo 1 /L化合物（I)處理48小時組細胞調亡率 分別為3·30±0·98、14·97±2·67、27·53±5·51 和55·90±5·1%。與對照組相比，各處理組 細胞的凋亡率顯著增加(Ρ〈〇.01)。結果見圖3。
[0062]結論:化合物（I)通過抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡發揮對人腦惡性膠質母細胞 瘤U251細胞的抑制作用。這些發現為化合物(I)治療膠質瘤的臨床藥物研究提供依據。 [0063] 表1不同濃度化合物（I)處理作用24~72h后U251細胞生存率(均數土標準差）
[0064]
[0065] 實施例4
[0066] 藥物組合物制備成片劑的應用：按實施例2方法先制得化合物（I)，以及利用有機 酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦 形劑重量比為1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0067] 實施例4
[0068] 藥物組合物制備口服液的應用：按實施例2方法先制得化合物（I )，以及利用有機 酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規口 服液制法制成口服液。
[0069] 實施例5
[0070] 藥物組合物制備膠囊劑或顆粒劑的應用：按實施例2方法先制得化合物（I)，以及 利用有機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽， 按其與淀粉重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0071] 實施例6
[0072] 藥物組合物制備口服液的應用：按實施例2方法先制得化合物（I )，以及利用有機 酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規加 注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
[0073] 實施例7
[0074] 藥物組合物制備無菌粉針的應用：按實施例2方法先制得化合物（I )，以及利用有 機酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶 于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍 干燥后無菌熔封得粉針劑。
[0075] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種裸花紫珠提取物在制備治療神經膠質瘤的藥物中的應用，其特征在于:裸花紫 珠提取物是裸花紫珠的地上部分分離提取獲得，提取步驟包括： (a) 將裸花紫珠的地上部分干燥、粉碎，用乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇 味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃 取物和正下醇萃取物； (b) 取正下醇取物除雜，先用10 %乙醇洗脫6個柱體積，再用70 %乙醇洗脫8個柱體積， 收集70 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物； (C)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，用二氯甲燒-甲醇梯度洗脫，收集 洗脫液;再用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等 度洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮裸花紫珠提取物。2. -種二祗化合物（I)在制備治療神經膠質瘤的藥物中的應用，其特征在于:二祗化合 物（I)屬于裸花紫珠提取物中的一種純物質，由裸花紫珠的地上部分分離提取獲得，它具有 下述結構式：3. 權利要求1所述的應用，其特征在于:二祗化合物（I)經過W下操作步驟獲得： (a) 將裸花紫珠的干燥地上部分粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮 至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸 乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b) 步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙 醇洗脫8個柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物； (C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1 和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分； (d) 步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。4. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為 75%。5. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。6. -種藥物組合物在制備治療神經膠質瘤的藥物中的應用，其特征在于：其中含有治 療有效量的權利要求1所述的化合物(I)和藥學上可接受的載體。7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:藥學上可接受的載體是淀粉。
【專利摘要】本發明屬于藥物技術領域，具體涉及從裸花紫珠的地上部分中分離得到裸花紫珠提取物、或二萜類化合物，以及由它們制備的藥物組合物在制備治療神經膠質瘤的藥物中的醫藥用途。體外試驗證明裸花紫珠提取物、二萜類化合物可以通過抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡發揮對人腦惡性膠質母細胞瘤U251細胞的抑制作用，可以用來開發成治療神經膠質瘤的藥物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/343, C07D493/08, A61K36/85
【公開號】CN105646516
【申請號】
【發明人】王賽波
【申請人】溫州統益生物醫藥科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月11日