一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測裝置及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測裝 置及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 頭孢噻呋是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑，其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但 抗菌作用較磺胺類藥物強，對大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭 陽性和陰性細菌有效，但對綠膿桿菌感染無效，最低抑菌濃度常低于lOmg/1，單用易引起細 菌耐藥性，故一般不單獨使用，主要與磺胺藥組成復方制劑。因此它又被稱為磺胺增效劑， 用于擴大抗菌譜，增強抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、 腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等。可與長效磺胺藥合用于耐藥惡 性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫臨床上不合理的使用，甚至濫用，以至于抗菌增效劑類 藥物在動物源性食品中的殘留會不可避免地發生。人類長期食用含有頭孢噻呋殘留的動物 性食品及其制品，將有可能對人類健康產生危害。因此為了加強對動物性食品中這類藥物 的監控，建立一種準確、快速、方便的頭孢噻呋殘留量檢測方法很有必要。
[0003] 目前，國內外檢測頭孢噻呋的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相-質譜聯用 (LC-MASS)法和酶聯免疫吸附(ELISA)法。在食品安全檢測中，往往先用ELISA初篩后再對陽 性樣本用HPLC或LC-MASS進行確證。上述方法中所用儀器設備安規復雜、成本高、對操作人 員技術要求高且不能立即顯示結果，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象進行 快速的在線檢測和監控。
【發明內容】
[0004] 針對以上技術問題，本發明公開了一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測裝置及其 制備方法，針對現有檢測頭孢噻呋技術的不足，建立一種檢測頭孢噻呋殘留的快速方法，使 其能更加快速、靈敏、簡便地檢測頭孢噻呋殘留，滿足了快速檢測的需要。
[0005] 對此，本發明采用的技術方案為： 一種頭孢噻呋半抗原，其具有式(1)所示的化學結構式：
[0006] 上述分子式的化學名為(6R，7R)-7-[2-(2-氨基丙酸噻唑-4-基)-(Z)-2-(甲基亞 胺基）乙酰胺基]-3- [ (2-呋喃基羰基)硫甲基]-3-頭孢烯-4-羧酸，其分子式為C22H21N5〇 9S3， MASS[M+H]峰值為596.4，熔點為249度。
[0007] 作為本發明的進一步改進，所述的頭孢噻呋半抗原采用以下步驟制備得到： 步驟S1:將頭孢噻呋鈉溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攪拌10~120分鐘，其 中，所述冰乙酸的摩爾量是頭孢噻呋鈉摩爾量的1~3倍;再加入水，二氯甲烷萃取，旋干有機 相，得到淡粉紅色固體； 步驟S2:取步驟S1中得到的淡粉紅色固體溶于DMF(二甲基甲酰胺）中，加入碳酸鉀及溴 丙酸，35~45 °C下反應2~8小時，采用二氯甲烷萃取過柱提純得所述頭孢噻呋半抗原。
[0008] 本發明還公開了一種頭孢噻呋免疫抗原，采用如上所述的頭孢噻呋半抗原制備得 至1J，將所述頭孢噻咲半抗原與DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二環己基碳二亞胺）、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)混合，于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶于pH值為8.0 的PBS溶液中，加入DMF后攪拌，然后將所述上清液逐漸加入其中，4°C下反應12h，離心后， 取上清液，透析純化，得到所述頭孢噻呋免疫抗原。
[0009] 作為本發明的進一步改進，所述透析純化時，在4°C下用生理鹽水透析3天，每天更 換3次透析液。
[0010] 本發明還公開了一種頭孢噻呋單克隆抗體，采用如上所述的頭孢噻呋免疫抗原與 免疫Balb/c小鼠經細胞融合，篩選得到分泌頭孢噻呋單克隆抗體的雜交瘤細胞，用獲得的 雜交瘤細胞采用體內誘生腹水法制備得到頭孢噻呋單克隆抗體。
[0011]優選的，所述頭孢噻呋單克隆抗體采用以下方法制備得到:使用所述頭孢噻呋免 疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強免疫三次后，采血測效價，待血清效價不再上 升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后脫頸致死小鼠，在無菌條件下取脾臟制備 脾細胞，與生長旺盛的小鼠骨髓瘤細胞按8:1的比例混合于50mL離心管，加入30mL無血清 IPMI1640培養基，1100r/min離心5分鐘棄上清，將細胞團輕輕振松，置于37攝氏度水浴中。 把lmL50%(體積百分比）PEG-4000緩緩加入細胞中，在1分鐘內滴完，同時輕輕攪動底部沉 淀，靜置1分鐘后，前30秒沿管壁緩慢勻速加入無血清培養基lmL，后30秒加入2mL，然后快 速加入27mL終止融合過程，1100r/min離心5分鐘，棄上清，用HAT選擇性培養基重懸后加到 已鋪有飼養細胞的96孔細胞培養板中，37攝氏度、體積百分比5%的C0 2條件下培養。7天后 換成HT培養液，待孔內的雜交細胞數量達到300個以上時，用間接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯免疫吸附測定)法篩選，選擇強陽性、抑制效果好、細胞生長旺 盛的孔進行有限稀釋克隆化，經3次以上的克隆培養和檢測，均呈陽性的孔內細胞即為分泌 單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞擴大培養以備單克隆抗體的制備;然后，采用體內 誘生腹水法生產頭孢噻呋單克隆抗體。
[0012] 作為本發明的進一步改進，所述體內誘生腹水法的步驟為:對小鼠腹腔注射液體 石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射所述雜交瘤細胞3~5X10 6/只，10天后，待小鼠腹部明顯 膨大時收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水得到所述頭孢噻呋單克隆抗體。
[0013] 本發明還公開了一種頭孢噻呋膠體金檢測裝置，其包括反應杯和檢測試紙，所述 檢測試紙包括底板，以及底板上依次鋪設的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙;所述反應杯里 含有膠體金標記的如上所述頭孢噻呋單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和控制 線，所述檢測線為采用如上所述的頭孢噻呋免疫抗原在硝酸纖維素膜上進行噴涂制得。
[0014] 作為本發明的進一步改進，所述控制線為采用兔抗鼠 IgG進行噴涂制得，所述檢測 線和控制線相互平行。優選的，所述檢測線和控制線距離至少〇.5cm。
[0015] 優選的，所述兔抗鼠 IgG是通過以下方法獲得： 用載體蛋白結合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為50yg~100yg/次，背部皮下分多點 注射，其中所述載體蛋白為常規的載體蛋白，優選人血清白蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋 白；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化;加強免疫，用合成的人工抗原與等 量弗氏不完全佐劑乳化，連續免疫4~5次，每次間隔4~8周，最后一次免疫后10~15天，以 ELISA法測其定效價達到105以上時，采血并分離收集高免血清，以飽和硫酸銨鹽析法提取 兔抗鼠 I gG抗體，-20 °C凍存備用。
[0016] 本發明還公開了如上所述的頭孢噻呋膠體金檢測裝置的制備方法，其包括以下步 驟： 步驟A:將頭孢噻呋鈉溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攪拌10-120分鐘，其中， 所述冰乙酸的摩爾量是頭孢噻呋鈉摩爾量的1~3倍;再加入水，用二氯甲烷萃取，旋干有機 相，得到淡粉紅色固體;將淡粉紅色固體溶于DMF中，加入碳酸鉀及溴丙酸，35~45°C下反應2 ~8小時，采用二氯甲烷萃取過柱提純得所述頭孢噻呋半抗原;利用碳二亞胺法將所述頭孢 噻呋半抗原與載體蛋白牛血清偶聯，制備得到頭孢噻呋免疫抗原； 優選的，所述頭孢噻呋免疫抗原的制備步驟為將所述頭孢噻呋半抗原與DCC、NHS混合， 于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶于pH值為8.0的PB