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苯丙素類化合物及其藥學上可接受的鹽和藥物組合物的制作方法_3

文檔序號:9881031閱讀:來源:國知局
-乙酸系統,甲醇:水:乙酸的體積比為10: 90:0.01,按出峰順序收集洗脫液,共收集7個流分,分別命名為麗-121,麗-122,11-123,11-124,ΜΜ-125,ΜΜ-126,ΜΜ-127,備用;
[0088] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-124用制備液相純化,制備液相色譜柱為:YMC, 20mm*250mm,流速:5ml /min,流動相為甲醇-水-乙酸系統,甲醇:水:乙酸的體積比為15:85: 〇. 01,收集洗脫液,重結晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0089]將實施例1至實施例5制備得到的化合物進行質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜 的檢測,結果證明所得化合物為:4'_葡萄糖基(6"_葡萄糖基)-3'_甲氧基苯基3-羥基-4-甲 基戊酸甲酯。其結構式如式(I)所示:
[0090]
[0091] 其質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜的譜圖數據如下:
[0092] HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z 601.2243,結合核磁特征,可得分子式為C25H38〇15,不 飽和度為7。
[0093] 4 匪R(400MHz,Me0D)S6.77((1, J = 2.3Hz,lH),6.70((1, J = 8.6Hz,lH),6.57((1, J =8.6Hz,2.3Hz,lH),5.47(s,lH),4.85(s,lH),4.67(t,lH),4.26(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.81(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0094] 13C-NMR(150MHz,CD30D): 176 · 5(C-1),151·4(C-4,),147·9(C-1,),141·5(C-3,), 114.7(C-2,),112.7(C-6,),109.1(C-5,),102.3(C"),101.1(C",),88.4(C-3),60.5(C-2), 55.1(-0CH 3),37.7(C-4),24.8(C-5),20.2(-CH3),61.5-77.8(glc-C)。
[0095] 實施例6苯丙素類化合物鹽的制備
[0096] 苯丙素類化合物鹽酸鹽的制備:
[0097]攪拌下將該化合物甲醇溶液中滴加飽和鹽酸至pH值2-3,攪拌下滴加乙腈,抽濾, 干燥得到白色粉末固體,即為化合物的鹽酸鹽。
[0098]苯丙素類化合物磺酸鹽的制備:
[0099] 在含有該苯丙素類化合物、溶劑、磺酸、中性油和促進劑的反應體系中加入堿金屬 的氫氧化物,加入溶劑、低級醇和助促進劑,通入二氧化碳,分離得到白色粉末固體,即為化 合物的磺酸鹽。
[0100] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽的制備:
[0101] 將溶于乙醇中的Κ0Η或NaOH加入該化合物中,攪拌下加熱回流反應,冷制室溫,攪 拌下滴加乙腈,抽濾,干燥得白色固體,即為該化合物的鉀鹽或鈉鹽。
[0102] 苯丙素類化合物銨鹽的制備:
[0103] 攪拌下將該化合物甲醇溶液中滴加飽和氨水至pH值9-11,攪拌下滴加乙腈,抽濾, 干燥得到白色固體,即為化合物的銨鹽。
[0104] 上述苯丙素類化合物鹽的譜圖數據:
[0105] 苯丙素類化合物鹽酸鹽:ESIMS顯示m/z 614.38,核磁特征1!1-匪1?(60(^取, 0)300):? NMR(400MHz,Me0D)S6.74((1, J = 2.3Hz,lH),6.67((1, J = 8.6Hz,lH),6.44((1, J = 8.6Hz,2.3Hz,lH),5.41(s,lH),4.80(s,lH),4.60(t,lH),4.21(m,2H),3.20-4.00(glc-H), 2.77(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0106] 苯丙素類化合物磺酸鹽:ESIMS顯示為m/z 642.77,核磁特征咕-麗1?(6001〇^, 0)300):? NMR(400MHz,Me0D)S6.78((1, J = 2.3Hz,lH),6.72((1, J = 8.6Hz,lH),6.59((1, J = 8.6Hz,2.3Hz,lH),5.48(s,lH),4.89(s,lH),4.69(t,lH),4.28(m,2H),3.20-4.00(glc-H), 2.83(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0107] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽:
[0108] 鉀鹽ESIMS顯示m/z616·17,核磁特征1H-NMR(600MHz,CD30D): 1H匪R(400MHz, Me0D)56.71(d ,J = 2.3Hz,lH) ,6.66(d ,J = 8.6Hz , 1H) ,6.54(d ,J = 8.6Hz , 2.3Hz , 1H), 5.44 (s,lH),4.81(s,lH),4.61(t,lH),4.26(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.80(s,lH),1.43,1.14 (s,6H)〇
[0109] 鈉鹽ESIMS顯示m/z 600.67,? NMR(400MHz,Me0D)S6.79(d,J = 2.3Hz,lH) ,6.63 (d,J = 8.6Hz,lH) ,6.47(d,J = 8.6Hz,2.3Hz,lH) ,5.34(s,lH) ,4.84(s,lH) ,4.67(t,lH), 4·20(m,2H),3·20-4·OO(glc-H),2·77(s,1H),1·43,1·14(s,6H)。
[0110] 苯丙素類化合物銨鹽:ES頂S顯示m/z 593.49,核磁特征1H-NMR(600MHz,CD30D): 4 匪R(400MHz,Me0D)S6.70((1, J = 2.3Hz,lH),6.69((1, J = 8.6Hz,lH),6.49((1, J = 8.6Hz, 2·3Ηζ,1Η),5.41(s,lH),4.76(s,lH),4.61(t,lH),4.23(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.77 (s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0111] 上述苯丙素類化合物鹽的部分結構式如式(Π )~式(VI)所示。
[0113]
[0114] 其中,式(π)為制備得到的苯丙素類化合物鹽酸鹽,式(m)為制備得到的苯丙素 類化合物的其中一種磺酸鹽,式(IV)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鉀鹽,式 (V)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鈉鹽,式(VI)為制備得到的苯丙素類化合物 的其中一種銨鹽。
[0115] 實驗例7應用試驗
[0116] 本發明所述苯丙素類化合物以及鹽對LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞氧化應激與 炎癥的影響。(為了實驗過程中記錄方便,以下將本發明所述的苯丙素類化合物標號為:藥 物MM-124,即本發明中所述的藥物MM-124即是指本發明式(I)所示苯丙素類化合物或其藥 學上可接受的鹽。)
[0117] 1材料與方法
[0118] 1.1藥品及儀器
[0119] 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),MTT購自 Sigma公司;小鼠巨·細胞Raw264 · 7 購自湘雅細胞庫;PBS; DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素;全自動酶標儀;恒溫 C02培養箱。
[0120] 小鼠白介素 l-f3(IL-1-f3)ELISA檢測試劑盒,批號:2014/06(96T);小鼠白介素6 (IL-6)ELISA檢測試劑盒,批號:2014/06(96T);小鼠腫瘤壞死因子-a(TNF-a)ELISA檢測試 劑盒,批號:2014/06(96T);小鼠一氧化氮(NO)ELISA檢測試劑盒,批號:2014/10(96T);小鼠 羥基自由基(OH)ELISA檢測試劑盒,批號:2014/10(96T)。
[0121] 1.2藥物制備
[0122] 首先用少量DMS0溶解,然后用DMEM稀釋至一定的濃度,使終濃度中DMS0含量少于 1%0 〇
[0123] 1.3細胞培養
[0124] 小鼠巨噬細胞Raw 264.7培養于含10%熱滅活(56°(:,3〇1^11)的胎牛血清卬83)、 10U/mL青霉素鈉、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養基中,37°C、5 % C02恒溫培養箱中孵育生長。
[0125] 1.4細胞活力測定
[0126] 細胞活力通過MTT法來測定。將細胞制成細胞懸液接種于96孔板(1 X 104個/孔)孵 育24h,再同步化24h,然后將不同濃度的藥物作用于細胞2h,然后再加入LPS(30yg/mL)刺激 24h,吸棄原培養基,每孔加入100yL的MTT(0.5mg/mL)繼續孵育4h,吸棄培養基,每孔加入 150yL的DMS0,搖床振搖10min,在490nm處測定吸光度。
[0127] 1.5 N0含量測定
[0128] Raw 264.7細胞接種于96孔板24h,再同步化24h,然后將不同濃度的藥物作用于細 胞2h,然后再加入LPS( 30yg/mL)刺激24h,最后收集上清液,并于lOOOOrpm離心5min,分裝上 清并置于_80°C保存備用。通過小鼠 N0試劑盒測定N0含量。
[0129] 1.6 炎癥因子TNF-a,IL-10,IL_6測量
[0130] 樣品取1.5制備好的樣品用于后續炎癥因子測定。細胞產生TNF-a,IL-lf3,IL_6的 量通過小鼠 TNF-a,IL-Ιβ,IL-6試劑盒來測定。
[0131] 1.7 0H含量測定
[0132] 樣品取1.5制備好的樣品用于0H因子測定。通過0H試
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