2-84h ； (2) 取步驟（1)的適量培養液，按10 _4,10 _5,10 _6稀釋，涂布于木塊上，30°C培養72h ; (3) 挑選菌落大的接種于發酵培養基中，30°C培養72-84h ; (4) 取適量培養液，按10 _4,10 _5,10 _6稀釋，涂布于濾紙上，30°C培養72h ; (5) 挑選濾紙被降解掉處的菌落，按1(Τ4,1(Τ5,10 1 希釋，涂布于剛果紅-CMC雙層平 板，30°C培養72h ; (6) 挑出透明圈大的單菌落，做液態發酵實驗，測定產纖維素酶能力，選擇2-3株酶活 高的做重復實驗，獲得產量最高的菌株--綠色木霉F4。
[0024] 發酵培養基的配方為：麥麩50g/L，預處理木質纖維素25g/L，微晶纖維素25g/L， 酵母膏 20g/L，KH2P04 0 . 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgS04 0 . 4g/L，ZnS04.7H20 6mg/L，MnS04.4H20 2. 5mg/L，CoCl；； 2mg/L。其中木質纖維素原料為玉米結桿，纖維素38. 2 wt%，半纖維素22. 1 wt%，木質素20. 2 wt%，灰分3. 9 wt%，用粉碎機粉碎至顆粒大小為l-5mm。采用稀酸蒸汽爆 破進行預處理，2wt%的硫酸，干物質濃度30wt%，蒸煮溫度190°C，停留時間5min。預處理后 原料干物質中纖維素含量為37. 3wt%，乙酸含量0. 6wt%，甲酸含量0. 5wt%，5-羥甲基糠醛含 量0· 05wt%，糠醛含量0· 03wt%，總酚含量0· 015wt%。
[0025] 剛果紅-CMC 雙層平板培養基配方為：KH2P04 lg，（NH4)2S04 0 . 7g，MgS04 0 . 3g， CaCl2 0. 15g，0. 5ml Mandel' s營養液，定容到500ml ......記為溶液⑴。
[0026] 下層為200ml溶液⑴中加入4g瓊脂。
[0027] 上層為lg CMC，0. lg去氧膽酸鈉，O.Olg剛果紅，溶于100ml溶液⑴中，加入lg瓊 脂。
[0028] 實施例2綠色木霉F4液態發酵產纖維素酶 以上述含抑制物的預處理玉米秸桿為碳源和誘導物，利用綠色木霉F4液態發酵生產 纖維素酶。具體過程如下： (1) 配制液體發酵培養基：麥麩50g/L，預處理玉米結桿50g/L，微晶纖維素25g/L，酵母 膏 20g/L，ΚΗ2Ρ04 0· 25g/L，CaCl2 0· 4g/L，MgS04 0· 4g/L，ZnS04 · 7H20 6mg/L，MnS04 · 4H20 2. 5mg/L, CoCl2 2mg/L ； (2) 將上述培養基置于500mL三角瓶中，121°C滅菌30分鐘，冷卻后接種綠色木霉F4， 30°C恒溫培養24h，轉速200rpm，獲得種子液； (3) 將上述種子液按10% (v/v)接種量接種到發酵培養基中，30°C發酵72h ; (4) 采用截留分子量大小為5 KD的超濾膜對綠色木霉F4發酵液進行濃縮；將910mL 濾紙酶活為12. 4IU/mL的發酵液濃縮30倍得到30mL濃縮的酶液，濃縮液的濾紙酶活為 365IU/mL，酶活損失僅1. 9%。
[0029] 發酵結束后，經檢測發酵液中與纖維素酶解相關的蛋白包括：外切葡聚糖酶 I，內切-1，4_β-木糖苷酶，β-葡萄糖苷酶，1，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶C， 外切-1，4-β-木糖苷酶，內切葡聚糖酶EG-1，阿拉伯呋喃糖苷酶/B-木糖苷酶，內 切-1，4- β -木糖苷酶C，NAD (Ρ)Η依賴性D-木糖還原酶，內切-1，4- β -木糖苷酶C等。
[0030] 測定FPA、CMC酶活、β -葡萄糖苷酶酶活，酶活測定底物分別采用濾紙、羧甲基纖 維素鈉和水楊素。酶活測定使用DNS法：以在50°C，pH5. 0條件下，lmin催化底物水解產 生相當于1 μ mol葡萄糖的還原糖定義為一個國際酶活力單位。水解液中的糖成分，采用高 效液相色譜（HPLC)法分析。
[0031] 酶解得率（％ )=糖液中還原糖總量（g) X0. 9X100/底物中纖維素量（g) 重復4批次的上述三角瓶試驗結果表明，濾紙酶活平均達到12. 4IU/ml，CMC酶活平均 為18. 5IU/ml，β -葡萄糖苷酶活平均為1. 7IU/ml。
[0032] 實施例3綠色木霉F4液態發酵產纖維素酶 處理工藝和操作條件同實施例2,不同之處在于：將制備的綠色木霉F4種子液分別接 種到5個相同的培養基中，在發酵24h后，分別加入1. 5g槐樹粉、山梨糖、纖維二糖、異麥芽 糖、葡糖酸，再培養72小時。重復進行3個批次，檢測不同樣品的FPA、CMC酶活、β-葡萄 糖苷酶酶活，如表1所述。
[0033] 表1不同樣品的酶活檢測結果(單位：IU/ml)
實施例4采用發酵粗酶液酶解預處理玉米秸桿 按照表2的配方在三角瓶中分別加入預處理玉米秸桿（PCS)、0. 05M檸檬酸緩沖液 (pH5. 0)和蒸餾水，采用實施例2制備的濃縮粗酶液進行酶解，酶解的干物質濃度為20%， 130 r/min，50°C振蕩酶解72 h，控制酶解體系的總質量為50g，酶加入量為0. 04、0. 05、 0. 06、0. 07、0. 08g/g纖維素。根據最終葡萄糖濃度(單位：％)，計算葡萄糖得率。
[0034] 表2 F4發酵酶液水解PCS試驗條件和結果
由表2可見，采用本發明綠色木霉F4菌株制備的纖維素酶液酶解預處理玉米秸桿，耐 受抑制物能力強，還原糖得率高，酶解效果好。
【主權項】
1. 一株綠色木霉F4,其分類命名為綠色木霉（ZricAoofe/TKg Kiriofe)，已于2008年 11月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2736〇2. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于：綠色木霉F4菌落在PDA平板上25°C培養 4天擴展5-lOcm，初期白色稀疏，后形成綠色產孢區，反面無色；可以在腐木，秸桿，有纖維 素的土壤，馬鈴薯，玉米粉上生長，生長最適pH值為5. 0-5. 5,生長最適溫度25-35°C。3. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于：綠色木霉F4是通過富集，木塊涂布篩選， 濾紙涂布篩選，剛果紅-CMC雙層平板篩選得到。4. 根據權利要求1所述的綠色木霉F4在生產纖維素酶方面的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于：綠色木霉F4發酵生產纖維素酶的pH值 為3. 0-6. 0,發酵溫度為23-35°C，發酵時間為48-120h。6. 根據權利要求1所述的綠色木霉F4在以預處理木質纖維素為培養基碳源和誘導物 發酵生產纖維素酶方面的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于：綠色木霉F4發酵生產纖維素酶的發酵 培養基為：麥麩l〇_50g/L，預處理木質纖維素10-60g/L，微晶纖維素5-30g/L，酵母膏 5-30g/L, KH2P04 0. l-10g/L, CaCl2 0. 01-3g/L, MgS04 0 . 01-3g/L, ZnS04· 7H20 0.01-50mg/ L，MnS04· 4H20 0· 01-20mg/L, CoCl2 0·01-50 mg/L。8. 根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于：所述的木質纖維素原料為玉米秸桿， 采用稀酸預處理或稀酸蒸汽爆破預處理。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：稀酸預處理條件為：酸濃度為 0· 5wt%-2. 5wt%，干物質濃度為10wt%-20wt%，溫度115-180°C，時間5-120min ;稀酸蒸汽爆 破預處理條件為：酸濃度0. 5wt%-2. 5wt%，干物質濃度25wt%-40wt%，溫度150-180°C，時間 5_20min〇10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：預處理木質纖維素擠壓脫水后直接加入 到發酵培養基中，擠壓脫水后干物質中，木糖含量lwt%-10wt%，纖維素含量30wt%-40wt%， 木質素含量15wt%-18wt%，乙酸含量0· 5wt%-2wt%，甲酸含量0· lwt%-〇. 5wt%，5-羥甲基糠 醛含量 〇· 〇lwt%-〇. 05wt%，糠醛含量 0· 02wt%-0. 08wt%，總酚含量 0· 005wt%-0. 015wt%。11. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于：當發酵10-24h后，加入山梨糖、纖維二 糖、槐樹粉、異麥芽糖、葡糖酸內脂等的一種或幾種，再發酵48-120小時。12. 根據權利要求6至11任一所述綠色木霉F4生產的纖維素酶在酶解預處理木質纖 維素方面的應用，其特征在于：將發酵后粗酶液采用2-50KD超濾膜進行濃縮，濃縮10-200 倍；采用濃縮的酶液對預處理木質纖維素原料進行酶解，酶加入量為〇. 01-0. lg/g纖維素。13. 根據權利要求12所述的應用，其特征在于：控制酶解體系的pH值為4. 8-5. 2,溫度 為48-52°C，干物質濃度為5wt%-30wt%。
【專利摘要】本發明公開了一株綠色木霉F4及其應用，其分類命名為綠色木霉（<i>Trichoderma</i><i>viride</i>F4），已于2008年11月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2736。該菌株在以預處理木質纖維素作為碳源和誘導物生產纖維素酶的過程中，能夠耐受預處理木質纖維素引入的多種抑制物，仍然可以高效產酶，分泌的纖維素酶成分全，酶活性高，對預處理木質纖維素底物的酶解適應性強。CGMCC No273620081110
【IPC分類】C12P19/14, C12P19/02, C12N9/42, C12R1/885, C12N1/14
【公開號】CN105647813
【申請號】
【發明人】唐開宇, 張全
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月5日