越大，值較大表示該菌株分解纖維素的能力越強。按照纖維素剛果紅鑒定培養基上形成透明圈的大小初步確定其產纖維素酶活性。
[0023]通過上述操作，獲得多株纖維素降解菌，其中在北京昌平區某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫初期采集的樣品中分離的菌種，命名為FHMl的，于2016年2月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC (單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101)，保藏編號為CGMCCN0.12138。對FHMl菌株進行光學顯微觀察和革蘭氏染色鑒定，菌株為短桿狀，有芽孢、無鞭毛，革蘭氏染色呈陽性。觀察菌株的菌落形態，菌落呈乳白色，表面光滑、不透明，呈半濕潤狀態，菌落圓形，小而扁平，生長迅速，見圖1。
[0024]實施例2 FHMl菌株分子生物學鑒定
對篩選得到的波茨坦短芽孢桿菌進行分子鑒定，按照以下步驟進行:挑取篩選菌株的單菌落接種于液體LB培養基中，50°C、150r/min搖床振蕩培養，在第2d取出培養液，5000r/min離心Imin取上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司提供)，提取菌落DNA;通用引物27F和1492R對提取的細菌DNA進行PCR擴增；27F序列為5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-37 ; 1492R序列為5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCGCA-3、將PCR產物進行序列測序，測序結果在NCBI數據庫中BLAST進行序列分析，并進行同源性比較。
[0025]波茨坦短芽孢桿菌的16S rDNA基因序列(請參見圖2)長度為1432bp，將基因序列提交到Genbank上，進行同源性比較，然后采用MEGA 6.0軟件繪制系統發育樹，見圖3，從而確定菌株的種屬。結果表明該序列與波茨坦短芽孢桿菌(B r e V i b a c i 11 u sborstelensis)的16S rDNA基因序列相似度高達100%，同時結合菌落形態特征、生理生化特征、菌體顯微特征確定FHMl菌株為波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillusborstelensis)。
[0026]實施例3波茨坦短芽孢桿菌生長測定
將波茨坦短芽孢桿菌株FHMl接種到CMC液體培養基中(CMC-Na 15.0g,NH4NO3 1.0g,Hf母膏1.0g, MgSO4 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸餾水100mL)，每隔2h取培養液，聯續取樣到48h，測定各時期的0D600值，以培養時間為橫坐標，各取樣點的0D600值為縱坐標，繪制該菌的生長曲線，即該菌的生長測定。從測定結果可以看出O-Sh為延遲期、9?16h為對數生長期、16?24h為穩定期、>26h為衰亡期。對數期的菌株的生長迅速、活力強，因此以后的發酵產酶實驗中，應選用12小時的發酵液為種子液進行接種。
[0027]實施例4波茨坦短芽孢桿菌產纖維素酶活力測定
將對數期波茨坦短芽孢桿菌株F HMI按I %的接種量接種到發酵培養基(培養基成分:CMC-Na 0.5%，蛋白胨 1%，麩皮 3%, NaCl 2%, KH2PO4 0.l%,MgS04.7H20 0.02%, (NH4)2SO4
0.3%),pH 7.0-7.6)中，于溫度50°C、rpml50轉搖床中培養3-4d，將培養物8000r/min離心5min，取上清即為粗酶液，用DNS法測定纖維素酶活。取I mL上清液于試管中(空白用Iml蒸餾水代替)，置于50°C水浴鍋中，預熱2min，然后加入4 ml已經在50°C預熱的底物溶液，計時反應5min后取出，加入4mL DNS顯色液，搖勻后放置于沸水浴中加熱5 min，取出后立即放入冷水浴中冷卻，用蒸餾水定容至20ml，混勻后在540 nm波長處測定吸光度。對照標準曲線后換算該菌株的產酶活力。酶活力單位按照國際單位規定定義，即在I mL體系中，在I min內催化纖維素水解生成I μπιο?葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U/mL)。經測定FHMl菌株的纖維素酶活性為19.8 U/mL。
[0028]實施例5固態腐熟劑的制備
(I)菌株活化:取本發明微生物4°C保存斜面接種至LB固體平板培養基，在50°C的恒箱中培養12h實現菌株活化。
[0029](2)種子液制備:將步驟(I)中經斜面活化的菌種平板I個接種至I L無菌LB液體培養基中，50°C 150rpm搖床條件下培養12 h后得種子液。
[0030](3)發酵種子液的制備:上述種子液按6_10%( v/v)的接種量接種至已滅菌的發酵罐中，進行擴大發酵培養。在溫度50°C、振蕩頻率120 rpm的條件下，培養48h后得發酵種子液。
[0031](4)固態腐熟劑的制備:將麥麩與玉米面按照2:1質量比混合后作為菌液吸附劑，與步驟(3)中制得的菌液，按菌液與吸附劑體積質量比1:1混合，制作成固態腐熟劑，堆置I周后，可用于高溫堆肥。
[0032]實施例6腐熟劑的堆肥效果試驗
以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態腐熟劑按物料重量的5%比例接種到堆肥物料中，進行高溫堆肥，以不加腐熟劑的材料為對照，當堆體溫度上升到50°C時，開始翻堆，高溫期每2天翻堆一次，降溫期每周翻堆一次，當溫度下降到40°C后不在翻堆。堆肥過程中，通過測定堆體每天的溫度變化、堆肥材料碳氮(C/N)比變化，考察添加腐熟劑對園林廢棄物堆肥腐熟進度的影響。
[0033]堆肥過程中堆體溫度變化如圖4所示。由圖4可知，接種腐熟劑的堆肥處理在堆肥第3d溫度上升到50°C以上，而且50°C以上的高溫期持續16d，之后溫度開始下降。而未接種的堆肥處理溫度在堆肥第4d才上升到50°C以上，比接種的處理推遲一天到達50°C以上高溫期，而且50°C以上高溫期持續時間是12d，比接種的處理少了4d，接種處理的堆體高溫期的最高溫度也高于未接種處理，說明接種腐熟劑后能夠加快堆肥進入高溫期時間，以及高溫期持續時間。堆肥過程中C/N變化如圖5所示。由圖5可知，隨著堆肥的進行，接種腐熟劑和不接種的處理C/N比均持續降低，而接種的處理下降程度高于未接種處理，由此說明，添加本菌制得的腐熟劑可以加快堆肥進程，提高園林廢棄物堆肥的腐熟效果。
【主權項】
1.一株耐高溫纖維素降解菌波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillusborstelensis)，保藏號為CGMCC N0.12138。2.一種適用于園林廢棄物為主要堆肥材料的高溫堆肥腐熟劑，其特征在于:該腐熟劑以液體發酵方式獲得，其原料為菌液及吸附劑，按菌液與吸附劑按比例混合，制作成固態菌劑，其中菌液為權利要求1所述的波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)菌液，吸附劑為麩皮和玉米面。3.如權利要求2所述的高溫堆肥腐熟劑，其特征在于:所述菌液濃度為5X 19 CFU/mL，麩皮和玉米面2:1混合作為菌液吸附劑，按菌液與吸附劑1:1混合，制作成固態菌劑。4.如權利要求2或3所述高溫堆肥腐熟劑在堆肥腐熟中的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態腐熟劑按物料重量的5%比例接種到堆肥物料中，進行高溫堆肥。
【專利摘要】本發明公開了一株耐高溫纖維素降解菌波茨坦短芽孢桿菌(<i>Brevibacillus</i><i>？borstelensis</i>)，保藏號為CGMCC？No.12138。本發明所述菌能在40-70℃高溫內大量產酶，纖維素酶活性高，具有耐高溫、高效降解纖維素特性，可將其作為微生物菌劑應用于高溫堆肥體系中，適用于園林廢棄物堆肥。CGMCC No. 1213820160218
【IPC分類】C12N1/20, C05F15/00, C05F17/00, C12R1/13
【公開號】CN105647832
【申請號】
【發明人】彭霞薇, 馮紅梅, 周金星, 鄭景明
【申請人】北京林業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月5日