殖，進而有利于提高石油的降解效率。在本發明的另一些實施例中，在上述培養過程中，可 以對含有皮特不動桿菌和石油的混合物進行攪拌處理。攪拌的轉速不受特別限制，本領域 技術人員可以根據實際情況靈活選擇，例如包括但不限于為150~200rpm。由此，有利于提 高石油的降解效率。
[0026] 根據本發明的實施例，石油的具體提供形式不受特別限制。在本發明的一些實施 例中，石油可以以含有石油的液體混合物形式提供。由于該皮特不動桿菌可以以石油作為 唯一碳源進行生長和繁殖，含有石油的液體混合物中可以不包含其他可以作為碳源的物 質，例如僅包括一些無機鹽類。在本發明的一些實施例中，該含有石油的液體混合物可以為 石油和無機鹽培養基的混合物。由此，皮特不動桿菌可以快速高效地生長和繁殖，進而能夠 有效降解石油。
[0027] 根據本發明的實施例，上述無機鹽培養基的具體組成不受特別限制，只要能夠提 供皮特不動桿菌生長所需的無機鹽物質即可。在本發明的一個具體示例中，無機鹽培養基 含有：NH4NO3 2g/L、Na2HP〇4.12H2〇 3.8g/L、KH2P〇4 1.5g/L、NaCl lg/L、MgS〇4 0.2g/L、 FeS〇4*7H20 0.05g/L，無水CaCl2 0.05g/L，pH 7.0~7.2。
[0028] 根據本發明的具體示例，該降解石油的方法可以包括以下步驟:將一環上述皮特 不動桿菌菌落接種于LB培養基中，并于28~30攝氏度、150~200rpm攪拌條件下進行培養， 得到皮特不動桿菌種子培養液;然后將上述得到的皮特不動桿菌種子培養液接種于含有石 油的無機鹽培養基中，并于28~30攝氏度、150~200rpm攪拌條件下進行培養。由此，皮特不 動桿菌生長和繁殖狀況較好，并能夠有效通過自身代謝降解石油，石油降解效率較高，可達 60%至90%，且該方法不需要頻繁接種，運行成本較低且操作簡單，可以實現連續運行。
[0029]下面詳細描述本發明的實施例。
[0030] 實施例1:具有石油降解能力的皮特不動桿菌Acinetobacter pittii SYJ1-3的篩 選
[0031] 篩選步驟:將從長慶油田現場10個長期被石油污染的土壤地表下方5~10cm處分 別獲取500g土壤樣品，混合均勻后，取10g混合后的土壤樣品加入到盛有1 OOmL LB培養基的 250mL搖瓶中進行微生物富集，具體為于28~30°C，180rpm條件下搖床培養5d，得到富集液， 吸取lmL上述得到的富集液并轉接至新鮮LB培養基中，繼續進行上述微生物富集，培養5d后 再吸取lmL得到的富集液并轉接至以石油為唯一碳源的無機鹽培養基(配方為:NH 4N03(2g/ L)、Na2HP〇4 · 12H2〇(3.8g/L)、KH2P〇4(1.5g/L)、NaCl(lg/L)、MgS〇4(0.2g/L)、FeS〇4 · 7H20 0 · 05g/L，無水CaCl2 0 · 05g/L，原油（5g/L)、pH 7 · 0~7 · 2，并于 121°C滅菌20min)中進行嗜 油菌的選擇和馴化，具體為于28~30°C，180rpm條件下搖床培養5d。重復上述嗜油菌的選擇 和馴化操作3次，然后用接種環蘸取少許經過馴化的培養液，在LB培養基平板上直接劃線分 離，在平板上選擇不同形態特征的菌落，重新轉接至以石油為唯一碳源的無機鹽培養基中， 于28~30°C，180rpm條件下搖床培養以驗證是否具有石油降解能力，培養液變渾后，用接種 環蘸取少許渾濁的培養液，在LB培養基平板上直接劃線分離，在平板上選擇單菌落重新畫 線分離純化，重復分離、純化操作3次。篩選得到能夠以石油作為唯一碳源生長，并降解石油 的菌株SYJ1-3。
[0032] 16S rDNA保守序列鑒定：從篩選得到的菌株SYJ卜3中提取DNA后，以該菌株的DNA 為模板，利用通用引物F27(5'AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQIDN0:1)和R1492(5'-ACGGTTACCTGTTACGACTT-3'，，SEQ ID N0:2)進行PCR擴增，其中，PCR反應體系為：lyL DNA模 板、2yL dNTP、2.5yL 10XPCR緩沖液、上述通用引物各lyL、0.2yL Taq酶、17.3yL去離子水。 PCR反應流程為:①94°C預變性(5min);②94°C變性(30s)，58°C退火(30s)，72°C延伸(90s); ③重復第二步，共30個循環;④72°C復性（10min);⑤4°C保持。接下來，將PCR擴增產物與 PMD18-T載體(Takara Acta Scientiae Circumstantiae公司生產）連接，轉化到大腸桿菌 感受態細胞。16S rDNA測序工作由中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)完成，DNA測序片段如下所示：
[0033] TCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGAT CCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGAT TAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATG ATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGACATTACTCGCTGGC AAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGC ACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTC GCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGA CCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACAT CGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTGTTAGGC CAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCT CTCCCACACTCTAGCTAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTAGC CGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAG TTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAGCCTCCTCcTCGCTTaAAGT GCTTTACAaCcATAAGGCcTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCA CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATC GTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATC CCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGAAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCC TAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAAGATC(SEQ ID NO：3)
[0034] 將測得的16S rDNA序列在GenBank進行Blast，序列比對結果表明，篩選得到的菌 種菌株SYJ1-3與T32、NCBI數據庫中Acinetobact