一種利用木糖生產乙醇酸的重組菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用木糖生產乙醇酸的重組菌及其構建方法與應用，屬于基因工 程技術領域。
【背景技術】
[0002] 有機酸是目前市場需要非常大的一類化合物，每年生產的有機酸約數百萬噸，應 用于食品、醫藥、化妝品、化工等眾多領域。同時有機酸也是利用代謝改造微生物合成的一 類重要的生物基產品。乙醇酸是一種最簡單的羥基酸，在眾多領域中都有重要的使用價 值，例如在化妝品行業：乙醇酸可以有效保護皮膚的柔韌性，提高皮膚的抗病性；乙醇酸復 合金屬離子后能夠作為一種去污清潔劑；乙醇酸的單聚體或者與其他有機酸的多聚體可以 作為性能良好的塑料，具有廣泛的工業應用價值。
[0003]目前乙醇酸的化學合成法主要通過高溫高壓條件下甲醛羧化形成，生物法主要通 過轉化乙二醇或者乙醛酸形成乙醇酸。化學合成的條件嚴苛，耗能大，污染嚴重，而生物法 合成由于污染小、原料可再生等優勢越來越受到重視。目前微生物法利用的碳源主要是植 物衍生的糖類和淀粉，然而木質纖維素原料的應用也是人們普遍重視的、未來生物技術的 重要研究方向。木質纖維素的主要組成成分為D-葡萄糖和D-木糖，D-葡萄糖能夠被多數微 生物代謝形成目標產品，而D-木糖的利用范圍相對較小，僅有少數微生物能夠代謝，鑒于此 原因，代謝工程改造仍然集中于以葡萄糖為底物的生物合成途徑的研究。D-木糖作為木質 纖維素的重要成分，來源廣泛、成本低，以D-木糖作為底物，生物法合成乙醇酸的研究具有 重要的科學和應用價值。但是現有技術中尚沒有以木糖為底物，利用該途徑成功合成乙醇 酸的報道。
【發明內容】
[0004] 為實現利用生物法以木糖為原料合成乙醇酸，本發明提供了一種利用木糖生產乙 醇酸的重組菌，所采取的技術方案如下：
[0005] 本發明的目的在于提供一種利用木糖生產乙醇酸的重組菌，該重組菌過表達木糖 脫氫酶基因，木糖酸內酯酶基因，木糖酸脫水酶基因，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 和乙醇醛脫氫酶基因。
[0006] 優選地，所述木糖脫氫酶基因，為來源于新月丙桿菌(Caulobacter crescentus) 的木糖脫氫酶基因 xdh;所述木糖酸內酯酶基因，為來源于新月丙桿菌（Caulobacter crescentus)的木糖酸內酯酶基因 xy 1C;所述木糖酸脫水酶基因，為來源于大腸桿菌 (Escherichia coli)的木糖酸脫水酶基因 yjhG;所述3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因， 為來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH;所述 乙醛酸脫氫酶基因，為來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的乙醇醛脫氫酶基因 aldA。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種所述重組菌的構建方法，該方法的步驟如下：
[0008] 1)克隆獲得木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xy 1C，木糖酸脫水酶基因 y jhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 y jhH，乙醇醛脫氫酶基因 aldA;
[0009] 2)將步驟1)所得的木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油 戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH連接到質粒載體，獲得重組質粒I;
[0010] 3)將步驟1)所得的木糖酸脫水酶基因 yjhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質粒 載體上，獲得重組質粒II;
[0011] 4)將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到宿主細胞，獲得重組菌。
[00?2] 優選地，步驟2)所述質粒載體，為質粒pETDuet-Ι。
[00?3] 優選地，步驟3)所述質粒載體，為質粒pACY⑶uet-Ι。
[0014]優選地，步驟4)所述宿主細胞，為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0015]所述方法的具體步驟如下：
[0016] 1)以新月柄桿菌的基因組DNA為模板，設計引物分別克隆木糖脫氫酶基因 xdh，木 糖酸內酯酶基因 xylC;以大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板，設計引物分別克隆木糖酸脫水 酶基因 yjhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH和乙醇醛脫氫酶基因 aldA;
[0017] 2)將步驟1)所得的脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油戊酮 糖酸醛縮酶基因 yjhH連接到質粒pETDuet-Ι上，獲得重組質粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC;
[0018] 3)將步驟1)木糖酸脫水酶基因 yjhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質粒 pACYCDuet-Ι 上，獲得重組質粒 pACYCDuet-1-aldA-y jhG;
[0019] 4)將步驟2)所得的重組質粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，將步驟3)獲得重組質粒 pACYCDuet-1-aldA-yjhG同時導入受體細胞E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌。
[0020] 優選地，所述方法步驟1)中所述木糖脫氫酶基因 xdh的Gene ID為7329904;所述木 糖酸內酯酶基因 xylC的Gene ID為7329903;所述木糖酸脫水酶基因 yjhG的Gene ID為 946829;所述3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH的Gene ID為948825;所述乙醇醛脫 氫酶基因 aldA的Gene ID為945672。
[0021] 優選地，所述方法步驟1)中克隆木糖脫氫酶基因 xdh所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.2所示;克隆木糖酸內酯酶基因 xylC所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；克隆木糖酸脫水酶基因 yjhG所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；克隆3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH所用引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID N0.8所示；克隆乙醇醛脫氫酶基因 aldA所用引物的核苷酸序 列如SEQIDN0·9-SEQIDN0·10所示。
[0022]所述重組菌在發酵生產乙醇酸中的應用在本發明的保護范圍之內。
[0023]所述應用的步驟如下：
[0024] 1)活化權利要求1或2所述的重組菌，獲得活化重組菌；
[0025] 2)將步驟1)所得的活化重組菌接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的M9液體培養基 中進行發酵培養。
[0026]優選地，所述應用中步驟2)所述發酵培養，是按1 %的接種量接種，在37°C，180rpm 的條件下培養至〇D6〇〇達到1.0時，加入100μΜ異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導，誘導后置于 30°C，180rpm的條件下繼續培養48h后終止發酵。
[0027]所述重組載體導入宿主菌的方法采用熱激轉化法。
[0028]本發明獲得的有益效果是：
[0029] 本發明以大腸桿菌這種模式菌株為宿主菌，實現了以D-木糖為底物，合成得到乙 醇酸，為D-木糖的生物利用以及乙醇酸的微生物合成提供了新的技術方法。
[0030] 本發明通過在大腸桿菌中過表達新月丙桿菌的木糖脫氫酶基因 xdh和木糖酸內酯 酶基因 xylC;同時過表達大腸桿菌MG1655的木糖酸脫水酶基因 yjhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖 酸醛縮酶基因 yjhH和乙醇醛脫氫酶基因 aldA，首次實現以D-木糖為碳源，經乙醇醛轉化形 成乙醇酸的生物合成路徑。
[0031] 定義和縮寫
[0032] 在本發明中使用下列的縮寫或簡稱：
[0033]木糖脫氫酶基因 ：xdh
[0034] 木糖酸內酯酶基因 ：xylC
[0035] 木糖酸脫水酶基因 :yjhG
[0036] 3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 :yjhH
[0037] 乙醇醛脫氫酶基因 ：aldA
[0038] 大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) :Ε·coli
[0039] 新月丙桿菌（Caulobacter crescentus) :C.crescentus
[0040] "熱激轉化"或"熱轉化"指分子生物學中轉染技術的一種，用來將外來基因整合到 宿主基因中并穩定表達，其利用受到熱激后，細胞膜出現裂隙，將外來基因導入宿主基因或 將外來質粒導入宿主原生質體，又熱激轉化或熱轉化等。
[0041] "過量表達"或"過表達"指特定的基因在生物體中大量表達，表達量超過正常水平 (即，野生型表達水平），可以通過增強內源表達或引入外源基因來實現。
【附圖說明】
[0042]圖1為利用木糖合成乙醇酸的代謝途徑示意圖。
[0043] 圖2為重組大腸桿菌發酵產物的高效液相色譜檢測；
[0044] (圖中，A為標準品;B為實驗組檢測發酵產物;其中箭頭所指的色譜峰為乙醇酸）。
【具體實施方式】
[0045]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0046]以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經特殊說明，均為本領域中的常規 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業渠道獲得。
[0047]所用酶試劑購自MBI Fermentas公司，提取質粒所用的試劑盒和回收DNA片段所用 的試劑盒購自美國OMEGA公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行;所有培養基如無特別 說明均用去離子水配制。
[0048]培養基配方：
[0049] 1)種子液搖瓶培養基
[0050] LB培養基:5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余為水，121°C，20min滅菌。 [00511 2)發酵生產搖瓶培養基
[0052] ]?9培養基：1(^/1〇171〇86，148/11(2冊04.3!12〇,5.2 8/11012?〇4，1區/1恥(：1，18/1 NH4CI,0.25g/L MgS〇4 · 7H2〇,0.2g/L yeast extract,20g/L glucose.
[0053]在實際培養過程中，可向上述培養基中添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩定 性，如l〇〇mg/L的氨節青霉素和50mg/L的氯霉素。
[0054]實施例1外源基因的克隆
[0055] 木糖脫氫酶基因：（xdh)(Gene ID:7329904)的克隆是以C.crescentus為模板，通 過PCR擴增獲得，引物序列為：xdh-F 5'-GGGAATTCCATATGTCCTCAGCCATCTATCCC-3'，xdh-R 5 ' -CGGGGTACCTCAACGCCAGCCGGCGTCGAT-3 ' ；木糖酸內酯酶基因 （xy