1C) (Gene ID: 7329903) 的克隆是以C.crescentus為模板，通過PCR擴增獲得，引物序列為：
[0056] xylC-F 5'-CCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAATTG-3，，xylC-R 5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAAACCAGACGAACTTCGTGCTG-3 ' ；木糖酸脫水酶基因（yjhG) (Gene ID: 946829)克隆是以E.C0li為模板，通過PCR擴增獲得，引物序列為：yjhG-F5'-GGAATTCCATATGTCTGTTCGCAATATTTTTGC-3 ' ,yjhG-R5 CCGCTCGAGTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCG-3 ' ； 3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 （y jhH) (Gene ID : 948825)克隆是以E . col i為模板，通過PCR擴增獲得，引物序列為：7北^5'_ CCGCCATGGCATGAAAAAATTCAGCGGCAT-3'，yjhH-R 5'-CCGGAATTCTCAGACTGGTAAAATGCCCT-3'； 乙醇醛脫氫酶基因（aldA)(Gene ID:945672)克隆是以E.coli為模板，通過PCR擴增獲得，弓丨 物序列為：aldA-F 5，-CCGCCATGGGATGTCAGTACCCGTTCAACA-3，，aldA-R 5'-CCGGAATTCTTAAGACTGTAAATAAACCA-3' ；克隆獲得基因利用膠回收試劑盒回收目的片段。 [0057] 實施例2重組質粒的構建
[0058] 1 ·重組質粒 pETDuet-1-y jhH-xdh-xylC 的構建過程
[0059] 1)實施例1克隆所得的木糖脫氫酶基因 xdh與載體pETDuet-Ι經NdeI、KpnI雙酶切 后，利用回收試劑盒回收酶切后目的片段xdh和載體pETDuet-Ι，再進行連接，連接產物轉化 E. coli DH5a，篩選陽性克隆，得到重組質粒pETDuet-1-xdh;
[0060] 2)實施例1克隆所得xylC基因與重組質粒pETDuet-1-xdh經EcoRI、NotI雙酶切后， 利用回收試劑盒回收酶切后目的片段xylC和載體pETDuet-1-xdh，再進行連接，連接產物轉 化E. coli DH5a，篩選陽性克隆，得到重組質粒pETDuet-1-xdh-xylC;
[0061 ] 3)實施例1克隆所得yjhH基因與重組質粒pETDuet-1-xdh-xylC經EcoRI、NcoI雙酶 切后，利用回收試劑盒回收酶切后目的片段yjhH和載體pETDuet-1-xdh-xylC，再進行連接， 連接產物轉化E.coli DH5a，篩選陽性克隆，得到重組質粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC;
[0062] 2 ·重組質粒 pACYCDuet-1-aldA-y jhG
[0063] 1)實施例1克隆所得的木糖脫氫酶基因 yjhG與載體pACYCDuet-1經NdeI、xhoI雙酶 切后，利用回收試劑盒回收酶切后目的片段yjhG和載體pACYCDuet-Ι，再進行連接，連接產 物轉化E. col i DH5a，篩選陽性克隆，得到重組質粒pETDuet-1-y jhG;
[0064] 2)實施例1克隆所得aldA基因與重組質粒pETDuet-1-yjhG經EcoRI、NcoI雙酶切 后，利用回收試劑盒回收酶切后目的片段aldA和載體pETDuet-1-yjhG，再進行連接，連接產 物轉化E. co 1 i DH5a，篩選陽性克隆，得到重組質粒pACYCDuet-1 -aldA-y jhG;
[0065] 實施例3重組菌株構建
[0066] 按照TAKARA感受態制備試劑盒的操作步驟制備野生型對照菌株E.coliBL21(DE3) 感受態，將重組質粒pETDuet-1-y jhH-xdh-xylC和pACYCDuet-1-aldA-y jhG通過熱激法轉化 至宿主菌株E.coliBL21(DE3)感受態細胞，得到重組菌株，編號為ZG-2562。
[0067]實施例4重組菌株的搖瓶發酵試驗
[0068]本實施例共進行三組實驗，三組實驗的其他條件均相同，不同之處具體如下：
[0069] 對照組1:野生菌株E · coliBL21 (DE3)，以木糖為碳源，進行發酵；
[0070]對照組2:重組菌株ZG-2562，以甘油為碳源進行發酵；
[0071]實驗組:重組菌株ZG-2562，以木糖為碳源進行發酵。具體的發酵過程如下：
[0072] (1)將活化后的野生菌株及重組菌株ZG-2562按1:100的比例接種到含有50mL的M9 改良液體培養基的250mL搖瓶中（內含100mg/L的氨芐青霉素和50mg/L的氯霉素），其中對照 組2加入10g/L甘油，其余兩組加入lOg/Ι木糖。37°C、180rpm條件下振蕩培養。OD600達到1.0 左右時，加入100μΜ/L IPTG誘導表達，誘導后置于30°C、180rpm繼續培養48h至發酵結束。 [0073] (2)取lmL發酵液，4°C，12000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測發酵產 物。
[0074] (3)液相色譜（圖2)證實實驗組得到了產物乙醇酸;在250mL搖瓶發酵水平，工程菌 株ZG-2562完全以木糖為碳源，乙醇酸的產量為2. lg/L，轉化率為46%。對照組1和對照組2 均沒有檢測到乙醇酸。由此表明，在不含有本發明的乙醇酸合成途徑時，野生菌株以木糖為 底物無法通過其他途徑合成乙醇酸。此外，即使含有本發明的合成途徑，無木糖存在時，重 組菌株也無法合成乙醇酸。本發明是以木糖為底物合成乙醇酸的一種新型的，高效的代謝 途徑。
[0075] 本領域技術人員應該理解，上述各個步驟均按照標準的分子克隆技術進行;上述 過量表達的5種基因共同克隆到大腸桿菌(E.coli)中，各個步驟均按照標準的分子克隆技 術進行。
[0076] 雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此 技術的人，在不脫離本發明精神和范圍內，都可以做各種的改動與修飾，因此，本發明的保 護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種利用木糖生產乙醇酸的重組菌，其特征在于，過表達木糖脫氫酶基因，木糖酸內 酯酶基因，木糖酸脫水酶基因，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因和乙醇醛脫氫酶基因。2. 權利要求1所述重組菌，其特征在于，所述木糖脫氫酶基因，為來源于新月丙桿菌 (Caulobacter crescentus)的木糖脫氫酶基因 xdh;所述木糖酸內酯酶基因，為來源于新月 丙桿菌(Caulobacter crescentus)的木糖酸內酯酶基因 xylC;所述木糖酸脫水酶基因，為 來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的木糖酸脫水酶基因 yjhG;所述3-脫氧-D-甘油戊酮 糖酸醛縮酶基因，為來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮 酶基因 yjhH;所述乙醛酸脫氫酶基因，為來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的乙醇醛脫 氫酶基因 aldA。3. -種權利要求1或2所述重組菌的構建方法，其特征在于，步驟如下： 1) 克隆獲得木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xy 1C，木糖酸脫水酶基因 y jhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH，乙醇醛脫氫酶基因 aldA; 2) 將步驟1)所得的木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油戊酮 糖酸醛縮酶基因 yjhH連接到質粒載體，獲得重組質粒I; 3) 將步驟1)所得的木糖酸脫水酶基因 yjhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質粒載體 上，獲得重組質粒Π ; 4) 將步驟2)和步驟3)所得的重組質粒導入到宿主細胞，獲得重組菌。4. 權利要求3所述構建方法，其特征在于，步驟2)所述質粒載體，為質粒pETDuet-Ι。5. 權利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)所述質粒載體，為質粒pACYCDuet-Ι。6. 權利要求3所述方法，其特征在于，步驟4)所述宿主細胞，為大腸桿菌BL21 (DE3)。7. 權利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 以新月柄桿菌的基因組DNA為模板，設計引物分別克隆木糖脫氫酶基因 xdh，木糖酸 內酯酶基因 xy 1C;以大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板，設計引物分別克隆木糖酸脫水酶基 因 yjhG，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因 yjhH和乙醇醛脫氫酶基因 aldA; 2) 將步驟1)所得的脫氫酶基因 xdh，木糖酸內酯酶基因 xylC和3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸 醛縮酶基因 yjhH連接到質粒pETDuet-Ι上，獲得重組質粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC; 3) 將步驟1)木糖酸脫水酶基因 y jhG和乙醇醛脫氫酶基因 aldA連接到質粒pACY⑶uet-1 上，獲得重組質粒 pACYO)uet-1-aldA-y jhG; 4) 將步驟2)所得的重組質粒pETDuet-1-yjhH-xdh-xylC，將步驟3)獲得重組質粒 pACYCDuet-1-aldA-yjhG同時導入受體細胞E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌。8. 權利要求1或2所述重組菌在發酵生產乙醇酸中的應用。9. 權利要求8所述應用，其特征在于，步驟如下： 1) 活化權利要求1或2所述的重組菌，獲得活化重組菌； 2) 將步驟1)所得的活化重組菌接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的M9液體培養基中進 行發酵培養。10. 權利要求9所述應用，其特征在于，步驟2)所述發酵培養，是按1 %的接種量接種，在 37°C，180rpm的條件下培養至OD600達到1.0時，加入100μΜ異丙基硫代半乳糖苷誘導，誘導后 置于30°C，180rpm的條件下繼續培養48h后終止發酵。
【專利摘要】本發明公開了一種利用木糖生產乙醇酸的重組菌及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。本發明提供的利用木糖生產乙醇酸的重組菌中過表達木糖脫氫酶基因，木糖酸內酯酶基因，木糖酸脫水酶基因，3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶基因和乙醇醛脫氫酶基因。同時，本發明還提供了該重組菌的制備方法及利用該重組菌的生產乙醇酸的方法。本發明首次實現了以D-木糖為碳源，經乙醇醛轉化形成乙醇酸的生物合成路徑。
【IPC分類】C12N15/70, C12N15/60, C12N1/21, C12N15/55, C12R1/19, C12N15/53, C12P7/42
【公開號】CN105647844
【申請號】
【發明人】趙廣, 咸漠, 劉敏
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日