一種Cronobacter sakazakii的類脂A結構突變株的構建及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種Cronobactersakazakii的類脂A突變株的構建及其應用，屬于基 因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 類脂A可以被宿主細胞表面的Toll樣受體4(Toll Like Receptor 4，TLR-4)識別， 繼而引發細胞內一系列的生理生化反應，產生TNF-α、IL-6、IL-8等多種炎性細胞因子。細胞 因子的種類和數量主要取決于類脂A的結構，因此，某些特殊結構的類脂A可作為疫苗佐劑， 非特異性的增強機體對抗原的免疫應答反應，提高疫苗效率。
[0003] 阪崎克羅諾腸桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種自然界中廣泛存在的食源性 革蘭氏陰性致病菌，主要污染嬰兒配方奶粉。它可以引起新生兒腦膜炎、敗血病、菌血癥及 壞死性小腸結膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革蘭氏陰性菌的致病能力與其外膜類 脂A的分子結構密切相關，但關于阪崎克羅諾桿菌類脂A分子修飾及作用還有待研究。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供C.sakazakii的類脂A分子修飾相關的突變株。
[0005] 本發明的第一個目的是提供一種Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基 因工程菌缺失了 ESA-02008基因片段。
[0006] 在本發明的一種實施方式，所述ESA-02008基因片段的核苷酸序列是SEQ ID N0:1 的序列。
[0007] 在本發明的一種實施方式，所述基因工程菌為無抗性C.sakazakii BAA894AESA-02008,以Cronobacter sakazakii BAA894為出發菌、缺失了核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 的 ESA-02008基因片段。
[0008] 在本發明的一種實施方式，所述基因工程菌的構建方法如下：將人工構建的ESA-02008 敲除片段電轉化入含 pKD46 質粒的 C. sakazaki iBAA894, 獲得突變株 C. sakazakii BAA894 Δ ESA-02008-loxPkan，再化轉入pKD-Cre質粒，通過位點特異性重組敲除卡那霉素 抗性基因；去除pKD-Cre(參考文獻：Yaning Han,Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants and Comparison of Immuno-Stimulatory Activities of Their Lipopolysaccharides,Marine Drugs，2013，11，363-376)質粒后獲 得無抗性1 ipid A的基因結構突變的基因工程菌。
[0009] 在本發明的一種實施方式，所述ESA-02008敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0010] 在本發明的一種實施方式，所述位點特異性重組為Cre酶介導的ΙοχΡ位點特異性 重組，最終42 °C培養去除pKD-Cre質粒，獲得無抗性類脂A的結構基因缺失的基因工程菌。
[0011] 本發明的第二個目的是提供一種降低Cronobacter sakazakii對陽離子抗菌肽抗 性和/或降低Cronobacter sakazakii細胞毒性和/或降低Cronobacter sakazakii菌株在 巨細胞中的繁殖水平的方法，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的ESA-02008基 因片段。
[0012] 本發明的第三個目的是提供所述基因工程菌在生產類脂A、制備疫苗或制備疫苗 佐劑方面的應用。
[0013] 在本發明的一種實施方式，所述生產類脂A，是先發酵培養收集基因工程菌菌體， 洗滌后用B1 igh-Dyer-相體系（氯仿/甲醇/水溶液，1: 2:0.8，v/v/v)懸浮菌體，磁力攪拌 0.5-1.5h，2000rpm離心30min分相，收集細胞碎片，加入12.5mM醋酸鈉 (pH 4.5)超聲波振蕩 2-10min，100 °C裂解30min;冷卻至室溫后，加入氯仿和甲醇配成B1 igh-Dyer二相體系（氯 仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm離心30min，取下相移移到旋蒸瓶中，旋轉蒸發;最后 加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)將lipidA洗出。
[0014] 在本發明的一種實施方式，所述應用是對基因工程菌的類脂A進行提取，然后利用 類脂A制備疫苗或疫苗佐劑。
[0015] 在本發明的一種實施方式，所述利用類脂A制備疫苗或疫苗佐劑，類脂A可以被宿 主細胞表面的Toll樣受體4(Toll Like Receptor 4，TLR-4)識別，繼而引發細胞內一系列 的生理生化反應，產生TNF-a、IL-6、IL-8等多種炎性細胞因子。細胞因子的種類和數量主要 取決于類脂A的結構，因此，某些特殊結構的類脂A可作為疫苗佐劑，非特異性的增強機體對 抗原的免疫應答反應，提高疫苗效率。鋁佐劑是目前全球公認的廣泛應用于人體的疫苗佐 劑，安全可靠，可顯著增強體液免疫反應，但是對細胞免疫的效果不夠理想。因此通過本發 明的類脂A的改造，來協助刺激免疫系統產生反應，增強疫苗的免疫力并減少疫苗的毒副作 用
[0016] 本發明的有益效果：
[0017] 本發明通過將Cronobacter sakazakii菌株的ESA-02008基因片段進行敲除，使 Cronobacter sakazakii菌株對陽離子抗菌肽抗性降低了32倍、Cronobacter sakazakii細 胞毒性降低了27%、Cronobacter sakazakii菌株在巨·細胞中的繁殖水平顯著降低，同時 還得到了發生結構突變的類脂A。本發明的結構突變的類脂A的修飾完全缺失，可以多產生 2500pg/mL的細胞因子TNF-α，細胞因子比野生型菌生產的類脂A增加了 1.6倍。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 ·ρΗ5 · 0 與pH7 · 0 條件下Cronobacter sakazakii BAA894 中 ESA-02008 的相對表 達量；
[0019] 圖2 · pH7 · 0 和pH5 · 0環境中 Cronobacter sakazakii BAA894 的類脂A 的 TLC 分析；1: ρΗ7 · 0BAA894類脂 A樣品；2: ρΗ5 · 0BAA894類脂 A樣品；
[0020]圖3 ·ρΗ7 · 0 和pH5 · 0 環境中 Cronobacter sakazakii BAA894 的類脂 A 的ESI/MS 分析； A: pH7.0BAA894類脂 A樣品；B: pH5.0BAA894類脂 A樣品；
[0021] 圖4 · Cronobactersakazakii BAA894 Δ ESA-02008在pH7 · 0和pH5 · 0類脂A樣品ESI/ MS分析；
[0022] 圖5. BAA894野生型及突變株對陽離子抗性肽抗性的MIC及抑菌圈；
[0023] 圖6.野生型突變株脂多糖刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7產生TNF-α的分析；
[0024] 圖7.野生型和突變株侵染Caco-2細胞；
[0025] 圖8 · C · sakazaki iBAA-894和C · sakazaki iBAA-894 Δ ESA-02008突變菌株的毒力。
【具體實施方式】
[0026]類脂A的的結構鑒定與分析：
[0027]薄層層析(TLC)檢測：將樣品點于Gel 60TLC板上，展層劑為氯仿/甲醇/水/氨水 (40:25:4:2, v/v/v/v)。層析結束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙醇的10%硫酸進行碳 化，置于加熱板上顯色。
[0028] ESI/MS分析:類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:l，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-T0F Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小 于m/z 2500。
[0029] C. sakazakii突變菌株在巨噬細胞內的存活能力：
[0030] THP-1細胞使用RPMI1640培養基+10%胎牛血清(含100U/mL青霉素，100yL/mL鏈霉 素，4500mg/L葡萄糖，2mmol/L L-谷氨酰胺），37°C，5%C02培養箱培養，800r/min離心5min 收集細胞，并用緩沖液洗去胰酶;細胞計數后重懸在無抗的細胞培養基中，向24孔組織 培養板各個孔中加入500yL細胞(約1 X 105個細胞）；在37 °C，5 %C02培養箱中過夜培養;過 夜培養的菌液按1 %的接種量轉接，37°C，200r/min培養3h;取lmL菌液，5000r/min離心5min 收集菌體;將菌體重懸至PBS緩沖液，并測定0D6QQ值；用無抗的細胞培養基將菌液稀釋至菌 體濃度大約為10 7cfu/500yL;倒掉過夜培養細胞的培養基，添加菌液500yL至24孔組織培養 板中，37°C，5 %C02培養箱中靜置培養45min，棄掉之前的培養基，加入含有100μg/ml慶大霉 素的新鮮培養基，培養45min。選取細菌刺激24h、48h、72h和96h四個時間點取樣