pCDFDuet-tac-TUkgsadh)發酵產物的示差檢測圖和紫外檢測圖，I、J為E · co 1 i W3110_ Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet_tac-gpdl-TUkgsadh)發酵產物的不差檢測 圖和紫外檢測圖）。 (五)【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 下列實施例中所使用的實驗方法若無特殊說明，均為常規方法。
[0033] 下列實施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0034]所用酶試劑購自TaKaRa公司，提取質粒所用的試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購 自愛思進生物技術有限公司，相應的操作步驟按照產品說明書進行；酵母粉、蛋白胨購自 0X0ID公司;所有的培養基如無特別說明均用去離子水配置。
[0035] "基因缺失"或"基因敲除"指將目的基因從基因組中刪除，從而使目的基因失去表 達，導致某些功能的缺失。
[0036] "電擊轉化"指分子生物學轉染技術的一種，用于將外來目的基因整合到宿主中并 穩定表達。主要利用高壓電脈沖的電擊作用將質粒或者基因片段導入到宿主。
[0037] "熱擊轉化"指分子生物學轉染技術的一種，用于將外來基因整合到宿主細胞中穩 定表達，其利用熱擊作用將外來質粒導入宿主細胞中。
[0038] "過表達"指特定的基因在生物體中大量表達，表達量超過正常水平。
[0039] 本實驗中所用菌株為E.coli W3110。
[0040] "擴增"是指在個體染色體或者質粒中額外的引入基因以便能夠過量表達。
[0041 ]培養基配方：
[0042] (1 )LB培養液：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余為水，121°C滅菌 20min〇
[0043] (2)LB固體培養基:20g/L瓊脂，5g/L酵母粉，1 Og/L NaCl，1 Og/L蛋白胨，其余為水。
[0044] (3)發酵培養基：甘油30g/L，NaCl lg/L，MgS〇4 · 7H20 0.25g/L，Na2HP〇4 · 12H20 22 · 7g/L，KH2P〇43g/L，酵母膏4g/L，（NH4) 2S〇43 · 2g/L，其余為水，121°C 滅菌20min。
[0045] 實施例1:質粒中啟動子的替換
[0046] 菌株及質粒：E · coli BL21 (DE3)購自 Transgen公司，表達質粒pACYCDuet-1、 pCDFDuet-1購自諾維信公司。
[0047] 質粒pACYCDuet-Ι和pCDrouet-Ι中啟動子的替換是通過同源重組將質粒上T7啟動 子的序列更換為tac啟動子的序列。
[0048]以pACYCDuet-Ι質粒T7啟動子替換成tac啟動子為例。培養含有質粒pACYCDuet-1 的大腸桿菌菌株，然后以pACYCDuet-1質粒為模板，利用突變引物使質粒模板上的T7序列突 變為tac，然后將用Dpnl內切酶消化模板后的反應液化學轉化進BL21 (DE3)感受態細胞中。 然后涂布于含50mg/L氯霉素的LB固體培養基平板上，PCR篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取 重組質粒進行測序驗證。驗證結果顯示T7啟動子序列(T7堿基序列：TAATACGACTCACTATA)成 功替換為tac啟動子(tac序列:TGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGT)。其中所用的替換引物序 列為：
[0049] I up:5 '-GGAAATTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3，
[0050] I down:5 '-CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAATTTCC-3 '
[0051 ] II up:5'-AGCTTTTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3'
[0052] II down:
[0053] 5 '-CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAAAAGC-3 ' 〇
[0054] 同理替換pCDFDuet_T7的啟動子為tac〇
[0055] 實施例2:
[0056] 1、肺炎克雷伯氏菌中甘油脫水酶及甘油脫水酶激活因子的克隆與表達
[0057] (1)菌株及質粒:肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae DSM 2026)購自德國DSM公司， E. coli BL21(DE3)購自Transgen公司，表達質粒pACYCDuet-tac為實施例1方法構建。
[0058] (2)甘油脫水酶基因（dhaB123)(dhaBlGene ID:7947197;dhaB2Gene ID:7947198; dhaB3Gene ID:7947200)和甘油脫水酶激活因子基因（gdrA)(gdrA Gene ID:6936977)的克 隆是以K. peneumoniae DSM 2026為模板，通過PCR擴增獲得。（擴增甘油脫水酶基因及甘油 脫水酶激活因子基因的引物序列為：DhaBl-4-F-EcoRl: CCGGAATTCATGAAAAGATCAAAACGA TTTGCAGTACT,DhaB1-4-R-Hi nd III：GTTAAGCTTGATCTCCCACTGACCAAA GCTGG)
[0059] 擴增的產物再經過Clean-up試劑盒回收目的基因片段。
[0060] (3)將質粒pACYCDuet-tac和回收后的目的片段用EcoRI和Hindlll酶切，回收酶切 產物，再進行連接，酶切后的載體PACY⑶uet-tac與目的基因片段按照摩爾比1:1的比例，16 °C連接12小時以上，連接產物轉化入E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，然后涂布于含有 50mg/L氯霉素的LB固體培養基平板上，PCR篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質粒進行 測序驗證。驗證結果顯示dhaB 123及gdrA與pACYCDuet-tac連接正確，獲得重組載體 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA〇
[0061] 2、巴西固氮螺菌中的α-酮戊二酸半醛脫氫酶的克隆與表達。
[0062] 菌株及質粒：表達質粒pCDFDuet-Ι購自諾維信公司。表達質粒pCDFDuet-tac為實 施例1方法制備，E · co 1 i BL21 (DE3)購自Transgen公司。
[0063]本發明所使用的α-酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSADH)來自自巴西固氮螺菌 A.brasilense(kgsadh Gene ID:95102055)。將該酶編碼的序列進行分析后對該基因進行 了化學合成，得到質粒pET-28(b)_kgsadh。以pET-28(b)_kgsadh質粒為模板通過多次定點 突變獲得120位谷氨酸突變為天冬氨酸及219位脯氨酸突變為丙氨酸的
[0064] pET-28 (b) -TUkgsadh 質粒。擴增引物為:El 20D-F:
[0065] AATGGTTCGCCGATGACGGCCGCCGTGTAT，E120D-R:
[0066] ATACACGGCGGCGTCATCGGCGAACCATT，P219A-F:
[0067] CTTCCTACCTGATCGCGCACCCTGTAATCCG，P219A-R:
[0068] CGGATTAVAGGGTGCGCGATCAGGTAGGAAG〇
[0069] 突變的α-酮戊二酸半醛脫氫酶的克隆是以PET-28(b)-TUkgsadh為模板通過PCR擴 增獲得目的基因 TUkgsadh，擴增引物為:K-NdeI-F: GGAATTCCATATGGCTAACGTGACTTATAC，K-Xhol-R:CCGCTCGAGTTACACTGCCATAACAG。再利用Clean-up試劑盒回收目的基因片段。
[0070] 將質粒PCDFDuet-tac和回收后的目的基因片段用Ndel和Xho頂每切，回收酶切產 物，再進行連接，酶切的pCDFDuet-tac載體與目的基因片段按照摩爾比1:3的比例進行連 接，16 °C連接12小時以上，連接產物轉化入E. co 1 i BL21 (DE3)感受態細胞中，然后涂布于含 有50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養基平板上，PCR篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質 粒進行測序驗證。驗證結果顯示突變的TUkgsadh與p⑶FDuet-tac連接正確，獲得重組載體 pCDFDuet-tac-TUkgsadh 〇
[0071] 3、釀酒酵母S.cerevisiae中甘油三磷酸脫氫酶的克隆與表達
[0072] 菌株及質粒：表達質粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh為步驟2方法構建，E.coli BL21 (DE3)購自 Transgen 公司。
[0073] 本發明所使用的甘油三磷酸脫氫酶(gdplGene ID: 851539)來自釀酒酵母，將該酶 編碼的序列進行分析后。對該基因進行了化學合成，得到質粒pET-28(b)-gpdl。以pET-28 (b)-gpdl質粒為模板通過PCR擴增獲得目的基因 gdpl，擴增引物為：GPDl-F-NcoI: CATGCCATGGATGTCTGCTGCTGCTGACCGT,GPD1-R-EcoRI:CCGGAATTCTTAGCAGCCGGATCTCAGTG 〇再 利用Clean-up試劑盒回收目的基因片段。
[0074] 將質粒pCDrouet-tac-TUkgsadh和回收后的目的基因片段用Ncol和EcoRI雙酶切， 回收酶切產物，再進行連接，質粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh與目的基因片段按照摩爾比1: 3 的比例進行連接，16 °C連接12小時以上，連接產物轉化入BL21 (DE3)感受態細胞中，然后涂 布于含有50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養基平板上，PCR篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取 重組質粒進行測序驗證。驗證結果顯示甘油三磷酸脫氫酶基因 gdpl與pCDFDuet-tac-TUkgsadh 連接正確，獲得重組載體 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh。
[0075] 4、glpR基因的敲除
[0076] 菌株及質粒：單敲除菌E · coli K12_glpR: : kan、E · col i W3110以及質粒pKD46和 pCP20購自耶魯大學CGSC菌種庫。
[0077]以單敲除菌E.coli K12-yqhD::kan菌株的甘油抑制因子替代基因的上下游約200 個堿基片段為模板設計引物，PCR擴增打靶片段，