再利用膠回收試劑盒收回目的基因片段。 [0078]擴增引物序列為：
[0079] gR-K-F：CGGATGGTTTGATTTGTTTGGGATG
[0080] gR-K-R：GGACGTGGTTGAAGATGAGATAAAC
[0081] 利用膠回收試劑盒回收的目的片段進一步用乙醇純化，以PKD46為媒介與 E.COliW3110野生菌進行同源重組敲除glpR基因，通過擴增引物驗證敲除glpR的 E·coliW3110工程菌，gp為E·coliW3110_ΔglpR。
[0082] 5、重組菌株的構建
[0083]通過在缺失甘油抑制因子基因（glpR)的大腸桿菌W3110菌株基礎上，過量表達外 源性甘油脫水酶基因（dhaB123)、甘油脫水酶再激活因子基因（gdrA)和α-酮戊二酸半醛脫 氫酶突變基因（TUkgsadh)，獲得重組E.coli W3110_AglpR，實現以甘油為碳源生產3-ΗΡ。 [0084]本領域技術人員應該理解，上述大腸桿菌(E.coli W3110)基因的缺失各個步驟按 照標準的分子克隆技術進行；上述過表達的幾種基因共同克隆表達到大腸桿菌(E.coli W3110_ △ glpR)中，各個步驟均按照標準的分子克隆技術進行;其中的α-酮戊二酸半醛脫氫 酶的定點突變均按照標準的分子克隆技術進行。
[0085] 將重組E.coli W3110_AglpR接種于50ml的LB液體培養基中，37°C培養至OD6〇〇約 為0.4時轉入50ml的離心管中，冰浴20min，使培養物冷卻至0°(：。4°(：，400(^離心101^11，棄上 清，再用預冷的0. lmol/L CaCl2水溶液重懸沉淀，冰浴30min。4"€，4000g，10min離心，棄上 清。再加入2mL預冷的0.1m〇l/L CaCl2(含有體積濃度15%甘油）重懸沉淀，分裝，-80°C保 存，得到感受態細胞。
[0086] 重組質粒 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA 和重組質粒 pCDFDuet-tac-TUkgsadh，重 組質粒口40￥0〇1161：-七&(3-(111&13123-8(1^和重組質粒口00?〇1161：-七&(3-8口(11-1'1]1^8&;(111雙質粒分 別通過化學熱擊法轉化入E. coli W3110_ Δ glpR感受態細胞，涂布于加有50mg/L氯霉素和 50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養基，通過PCR篩選獲得陽性克隆，獲得重組大腸桿菌E. col i W3110_ Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)和重組大腸桿菌 E.coli W3110_ Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh)。同 樣條件下制備對照重組大腸桿菌E · coli WSllCKpACYCDuet-tac-dhaBI^S-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh) 〇
[0087] 實施例3:重組菌株的搖瓶發酵試驗及重組菌株實施SDS-PAGE目的蛋白的表達 [0088]將實施例2方法構建的重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素 LB培養基，在37 °C培養16h，獲得活化后的重組大腸桿菌。
[0089]將活化后的重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素 LB液體培 養基，在37 °C培養1 Oh，獲得種子液。
[0090]將種子液按照體積濃度6 %的接種量接種到裝有50mL的含50mg/L氯霉素和50mg/L 硫酸鏈霉素的發酵培養基的250mL搖瓶中，37°C、150rpm振蕩培養。當0D6Q()達到0.6左右時， 向發酵液中分別加入IPTG，終濃度分別為0、0.01mM、0.25mM及0.5mM，同時分別加入終濃度 5g/L的VB 12，在28 °C、150rpm條件下誘導發酵42h。
[0091 ]取加入誘導劑發酵培養12h后的發酵產物2mL，12000g離心2分鐘收集菌體，菌體細 胞用生理鹽水洗滌兩次后用400yL pH 8.0、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，取20yL懸 浮液加入等體積2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴煮20分鐘，10% SDS-PAGE電泳檢測，即可 檢測目的蛋白的表達情況(其中甘油脫水酶DhaB123分子量中的亞基的大小分別為:α亞基： 62KD，β亞基：21KD，γ亞基：12KD;甘油脫水酶激活因子GdrA: 62KD; α-酮戊二酸半醛脫氫酶 KGSADH:54KD)。
[0092]同時誘導發酵42h后取lmL發酵液，4°C離心1.5min，取上清用高效液相色譜檢測發 酵產物，樣品分析前經〇.22μπι微濾膜過濾。發酵液中3-HP、甘油用HPLC測定，色譜柱為 Aminex ΗΡΧ-87Η柱，柱溫60°C，流動相為5mMH2S〇4，流速為0.6mL/min。檢測器為紫外檢測器 與折光示差檢測器，進樣量為20yL，采用外標法定量。3-羥基丙酸標準品的紫外出峰時間為 12. lmin，乳酸標準品的紫外出峰時間為11.7min，甘油標準品示差出峰時間為12.5min，1， 3-PD0標準品的出峰時間為16.2min。
[0093] 表1.重組大腸桿菌發酵對比
[0094]
[0095] 注：Δ glpR-K-D : E · co 1 i W3110_ Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA/ pCDFDuet-tac-TUkgsadh)；
[0096] Δ g 1 pR-K-G-D :E.coli W3110_AglpR( pACYCDue t-tac-dhaB 123-gdr A/pCDFDue t-tac-gpdl-TUkgsadh);
[0097] 0、0 · 01、0 · 25及0 · 50代表不同 IPTG誘導濃度(mM)。
[0098] 實驗結果表明（圖7和表1所示），在搖瓶發酵實驗中發現，未敲除甘油抑制因子且 未表達甘油三磷酸脫氫酶基因的對照組菌株E.coliW3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pO)FDuet-tac-TUkgsadh)，其3-HP產量僅為0.29g/L。而敲除甘油抑制因子后，菌株 E · col i W3110_ Δ glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)的3_羥基 丙酸產量提高至3.29g/L;進一步表達甘油三磷酸脫氫酶基因后，重組菌種E.coli W3110_ A glpR(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh)3-羥基丙酸產量達 到3.46g/L，實驗結果表明，敲除甘油抑制因子GlpR對于生成3-HP具有良好的作用，提高了 3-HP的產量。
[0099]雖然本發明已經公開了示例性示范方案，但是本領域人員應該理解，在不背離由 后附的權利要求所定義的本發明的精神和范圍的條件下，可以進行各種形式和細節的變 化，可以進行各種實驗方案的任意組合。
【主權項】
1. 一種生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將甘油脫水 酶基因 dhaB123、甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA、a-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體編碼基因 TUkgsadh和甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl導入宿主菌中構建而成;所述宿主菌為敲除甘 油抑制因子基因 glpR的大腸桿菌，所述酮戊二酸半醛脫氫酶突變體是將α_酮戊二酸半醛 脫氫酶的120位谷氨酸突變為天冬氨酸，219位脯氨酸突變為丙氨酸獲得的。2. 如權利要求1所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述甘油脫水酶基 因 dhaBl 23和甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA通過重組載體pACYCDuet-tac-dhaB 123-gdrA 導入宿主菌中。3. 如權利要求1所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述α-酮戊二酸半 醛脫氫酶突變體基因 TUkgsadh通過重組載體pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh導入宿主菌中。4. 如權利要求1所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述甘油三磷酸脫 氫酶編碼基因 gpdl通過重組載體pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh導入宿主菌中。5. 如權利要求1所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述大腸桿菌為 E.coli W3110。6. -種權利要求1所述生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌在合成3-羥基丙酸中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述的應用：將重組大腸桿菌接種至含50mg/L 氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素發酵培養基中，在37 °C、150rpm條件下振蕩培養至0D6Q()達到0.4 ~0.8時，向發酵液中加入終濃度0.01~0.5mM的IPTG，同時加入終濃度5g/L的VB12，在28°C、 150rpm條件下誘導發酵，發酵結束，獲得含3-羥基丙酸的發酵液;所述發酵培養基濃度組成 為：甘油 10-30g/L，NaCl lg/L，MgS〇4.7H20 0.25g/L，Na2HP〇4.12H2〇 22.7g/L，KH2P〇4 3g/ L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇4 3.2g/L，溶劑為去離子水，pH值為7.00。8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于所述IPTG終濃度為0.0 lmM。9. 如權利要求7所述的應用，其特征在于所述重組大腸桿菌在發酵培養前先進行斜面 活化和種子培養，所述斜面活化為:將重組大腸桿菌接種至LB固體培養基，在37 °C培養16h， 獲得活化后的重組大腸桿菌;所述種子培養為:將活化后的重組大腸桿菌接種至LB液體培 養基，在37 °C培養1 Oh，獲得種子液。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于所述種子液按體積濃度6%的接種量接種至 發酵培養基。
【專利摘要】本發明公開了一種生產3-羥基丙酸的重組大腸桿菌及應用，所述重組大腸桿菌是將甘油脫水酶基因dhaB123、甘油脫水酶再激活因子基因gdrA、α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體編碼基因TUkgsadh和甘油三磷酸脫氫酶編碼基因gpd1導入宿主菌中構建而成；通過利用基因敲除技術解除甘油進出細胞的抑制，同時再生醛脫氫酶的輔因子NAD+，從而提高3-HP產量，提高了12倍。
【IPC分類】C12N1/21, C12R1/19, C12P7/42
【公開號】CN105647845
【申請號】
【發明人】鄭裕國, 牛坤, 熊濤, 秦海彬, 黃建峰, 柳志強
【申請人】浙江工業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日...