產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌及其應用，屬于基因工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]L-抗壞血酸(即維生素C，VC)是一種人體自身不能合成但在體內發揮重要生理作用的水溶性維生素。可用來防止壞血病，促進傷口愈合;還可作為還原劑，紫外線吸收劑和黑色素形成抑制劑用于化妝品中。但位于2位碳的羥基極不穩定，導致VC還原性強，極不穩定，易被熱和氧化劑破壞，尤其是光，重金屬等物質能促進其氧化，使其在應用方面收到限制。
[0003]2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)是一種L-抗壞血酸的衍生物，是由日本林原生物化學研究所與同山大學藥學系共同發現的，可作為美白劑添加到化妝品中，且由于VC分子上的C-2羥基被葡萄糖苷所取代，其C-2位上有葡萄糖基掩蔽，故其具有較高的穩定性和抗氧化性，是良好的VC替代品。
[0004]用于催化VC生成AA-2G的酶有以下五大類，分別為環糊精葡萄糖苷轉移酶，a-淀粉酶，蔗糖磷酸酶，a-異麥芽糖基葡糖基形成酶，a-葡糖苷酶。其中最具工業化前景的兩種酶為環糊精葡萄糖苷轉移酶和a-異麥芽糖基葡糖基形成酶，使用環糊精葡萄糖苷轉移酶的最多。a-異麥芽糖基葡糖基形成酶因其酶表達量很低，不利于AA-2G的生成，因此一般要和環糊精葡萄糖苷轉移酶一起使用。環糊精葡萄糖苷轉移酶的主要來源是細菌Bacillus和KlebsielI屬。該酶最大的優勢為轉化效率較高，但在反應過程中會生成中間產物AA-2Gs，故需要進一步利用葡糖淀粉酶將其水解為AA-2G，但目前CGTase的酶活比較低，相關文獻中Peanibacillus macerans產出的CGTase胞內酶活水平在0.8U/mg DCW左右。
[0005]E.coli具有遺傳背景清楚、生長速度快、成本低、表達量高、操作簡單、表達產物易純化等優點，是基因表達技術中發展最早和目前應用最廣泛的經典表達系統。然而，由于E.coli過高的表達水平以及缺乏真核生物的蛋白加工體系，容易導致錯誤折疊的蛋白聚集形成包涵體，產生沒有活性的酶。常用的促進蛋白可溶性表達的方法有降低蛋白合成速度，如降低誘導溫度;優化培養條件，如優化培養基，誘導時間；利用分子伴侶和折疊酶等輔助蛋白共表達等。通過以上方法，均可有效提尚蛋白可溶性表達，從而提尚酶活。
[0006]分子伴侶的概念是由Lasky在1978年首先提出的，他將細胞核內能與組蛋白結合并介導核小體有序組裝的核質素稱為分子伴侶。根據ELLis的定義及后續研究，分子伴侶概念延伸為:它們結合并穩定其它蛋白質的不穩定構象，通過可調控的結合和釋放，促進細胞內蛋白質的正確折疊、跨膜轉運、寡聚體組裝、蛋白與細胞內其它組分的相互作用、有活性和無活性蛋白構象的轉換、胞內轉運以及蛋白質降解;并且當底物蛋白恢復到正確的天然結構并發揮正常生理功能時，分子伴侶不再與底物蛋白結合。DnaK屬于Hsp70家族，其輔助伴侶為DnaJ(屬于Hsp40家族)和核苷酸交換因子GrpE。部分科學家認為，DnaK的結合能使去折疊蛋白保持在可折疊狀態。當去折疊蛋白從DnaK解離后，一部分能夠自發折疊成天然構象。而另一部分折疊緩慢的中間體能反復被Hsp70系統結合與釋放，從而阻止肽鏈中間體的錯誤聚集，促進蛋白質正確折疊。經過該系統后，將有5-18%的蛋白質折疊為天然結構。GroEL屬于伴侶蛋白，其輔助伴侶為GroES。當蛋白質翻譯完成后，利用DnaK系統不能實現正常折疊的蛋白將被轉移至伴侶蛋白。故可將分子伴侶和含目的基因的質粒一起導入，有效地使蛋白正確折疊，從而提高酶活。
[0007]目前，在生產AA-2G方面，日本林原公司在市場上占有壟斷地位。AA-2G的價格是VC的100多倍，可見其具有較高的市場價值，但在我國，對于生產AA-2G的研究尚在初步探究的階段，還未達到工業化的水平，并且其后的分離提純工藝也需耗費人力物力，有效提高轉化率，節約生產成本，簡化生產工藝也是當務之急。
[0008]在糖基供體的選擇中，α-環糊精轉化率高，但其價格較為昂貴，不適合工業化生產使用;環糊精溶解性較低，轉化率略低，但價格便宜；其余的糖基供體轉化率很低。因此，本發明過程后期的轉化過程選用環糊精作為糖基供體，由于其溶解性低，故采用多次分批添加β-環糊精，提高AA-2G的產量。
【發明內容】
[0009]本發明所要解決的技術問題是提高環糊精葡萄糖苷轉移酶的酶活，提供一種產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌及其應用。
[0010]—種產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌，該基因工程菌是將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因通過載體導入到宿主細胞中得到的，其可將產生的環糊精葡萄糖苷轉移酶留在細胞內；其中所述的載體為質粒載體pET28a。
[0011 ] 所述宿主細胞中導入有含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質粒PGKJE8。
[0012]所述的基因工程菌的制備方法，包括如下步驟:
1)將質粒PGKJE8轉入感受態宿主細胞中，挑選出轉化菌株，制成感受態細胞；
2)將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因導入到質粒載體pET28a中，構建得到pET28a-cgt表達質粒，然后轉入感受態細胞中，通過選擇培養基挑選得到基因工程菌。
[0013]所述的基因工程菌在產環糊精葡萄糖苷轉移酶中的應用，包括如下步驟:
1)將基因工程菌接種至種子培養基，進行種子培養；
2)將步驟I)培養好的種子培養液接種至發酵培養基中，30°C培養2-8h，加IPTG，繼續培養至24h，停止發酵，離心，棄上清，用磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得環糊精葡萄糖苷轉移酶粗酶液。
[0014]為了進一步提高酶活，本發明優化了培養條件，
IPTG 濃度為 0.0 ImM-0.4mM。
[0015]所述發酵培養基中碳源濃度為5_30g/L，優選為15g/L。
[0016]所述的碳源可以為葡萄糖或者麥芽糖，優選為麥芽糖。
[0017]所述的基因工程菌在產2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸中的應用。
[0018]所述環糊精葡萄糖苷轉移酶來源于嗜堿性軟化類芽孢桿菌(PeanibaciIlusmacerans ) ,GenBank登錄號為X59045，優化密碼子后人工合成得到環糊精葡萄糖苷轉移酶基因cgt。
[0019]所述宿主細胞可以為細菌或真菌細胞。
[0020]基因工程菌的構建方法:將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因連接到質粒pET_28a上，得到包含環糊精葡萄糖苷轉移酶基因的重組質粒pET28a-cgt，然后將重組質粒pET28a-cgt轉化到大腸桿菌BL21 (DE3 )中，得到重組菌BL21 -pET28a_cgt。
[0021]包含有分子伴侶的基因工程菌的構建方法:將質粒pG_KJE8(購自Takara，含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL)轉入E.Coli BL21感受態細胞，將攜有分子伴侶質粒的菌株E.Coli BL21-pGKJE8制備成感受態細胞；將構建好的pET28a_cgt表達質粒轉化入E.Coli BL21-pGKJE8感受態細胞，構建出BL21-pGKJE8-pET28a-cgt菌株。所述菌株將含有分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質粒pGKJE8和pET28a_cgt—并導入宿主細胞中，實現共表達，可以有效提尚蛋白的正確折置率，從而減少包涵體的形成，提尚酶的正確表達率，提尚酶活。
[0022]所述含環糊精葡萄糖苷轉移酶基因導入的載體為PET28a，使酶留在細胞內，便于酶液的保存，同時也有利于酶液濃縮。
[0023]本發明應用于AA-2G的生產，反應底物為L-抗壞血酸和β-環糊精，環糊精葡萄糖苷轉移酶酶量為50U/mL-200U/mL，溫度為30-45°C，pH為4.0-6.0，反應時間20_28h，而后加入糖化酶35-55 °C反應20-28h。
[0024]有益效果:本發明構建了產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌，該菌株能夠使酶留在胞內，便于保存濃縮。優化了菌株的發酵培養條件，利用麥芽糖為碳源，培養基成分簡單，且有利于酶活的提高，使酶活由0.61U/mg DCW提高到2.0OU/mg DCW。優選的構建了含有分子伴侶的菌株，可以有效減少包涵體的形成，使錯誤折疊的蛋白重新正確折疊，從而有效地提高酶活。酶活可由原始菌株的2.0OU/mg DCW提高到7.82U/mg DCW。通過酶活的提高可以有效提高2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸產量。
[0025]具體實施案例
以下實施例中采用的環糊精葡萄糖苷轉移酶基因是:根據來源于嗜堿性軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans )的環糊精葡萄糖苷轉移酶(GenBank登錄號為X59045)進行密碼子優化人工合成得到環糊精葡萄糖苷轉移酶基因，基因序列如SEQ.N0.1所示。
[0026]實施例1菌株的構建
pET28a-cgt表達質粒的構建:采用化學合成法合成環糊精葡萄糖基轉移酶基因序列cgt。用于構建大腸桿菌的質粒是pET28a，帶有T7啟動子。將pET28a的質粒用XhoI和BamHI雙酶切，酶切產物膠回收。對含有cgt基因的質粒進行菌落PCR，引物如下:
正向引物5 ’ -CAGCAAATGGGTCGCGGATCCAGTCCTGACACCAGCGTGG-3 ’
PCR 條件:94°C 預變性 5min;隨后 30 個循環(94°C45s，57°C45s，72°C2min30s);72°C 再延伸1min0
[0027]進行膠回收，將膠回收好的PCR過的基因與膠回收好的酶切過的質粒一步克隆，轉化入BL2UDE3)中，轉化的具體步驟如下:將裝有200μ1制作好的感受態細胞冰盒上解凍5-1Omin ；加入20μ1冷卻的一步克隆反應液;手指輕彈，混勻，冰上放置30min; 42°C，水浴90s，冰浴2min;加入900ylLB培養基，復蘇細胞，37°C，200rpm，培養lh。取ΙΟΟμΙ涂布在抗性平板上，37 °C培養箱培養過夜，長出的菌即為轉化成功的菌株。經37 0C培養過夜后，進行轉點，提取質粒后酶切驗證，得到的菌BL21-pET28a-cgt中成功轉化有表達質粒pET28a-cgt。
[0028]實施例2
分子伴侶共表達體系的構建步驟如下:
步驟1:制備E.Co I i BL21感受態細胞(在無菌條件下操作):將BL21菌體加入5ml的LB試管中，37°(:，200印111，培養1211;取11111菌液接種到10011111^搖瓶中，37°(:，200印111，培養至00600=
0.5-0.6，冰上放置101