鹿血清的分離制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種鹿血清的生產工藝，尤其涉及一種鹿血清的分離制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前細胞培養工藝與方法已廣泛應用于醫藥、醫療、生物工程、基因工程、疫苗生 產等領域，其中細胞培養液在生物技術產品的生產和研究中成為無可替代的生物材料。當 前國內市場上所流通的細胞培養液，主要為含小牛血清或胎牛血清的細胞培養液，以及一 些無血清的細胞培養液。其中所使用的牛血清絕大部分來自澳大利亞、新西蘭等國，而國內 的牛血清來源主要集中在市場底端，原料大多來自于屠宰牛血。
[0003] 近幾年世界上發生瘋牛病事件后，從根源上對細胞培養液產業形成了結構性的影 響和沖擊，尤其是如果在細胞培養液中檢出瘋牛病毒會產生極其嚴重的后果。當前市場上 在醫藥、醫療、生物材料，基因工程、疫苗生產等領域，所使用的以牛源血清為基礎的各種細 胞培養基面對瘋牛血可能會發生流行的風險是客觀的，因此需要更安全的細胞培養液來替 代牛源血清細胞培養液。但由于用于珍貴細胞培養的血清培養基大多從國外進口，價格比 較昂貴，給使用單位造成較大的成本負擔。因此在上述背景情況下，如何提供一種直接取代 小牛血清、胎牛血清的動物血清成為當前細胞培養液技術領域的一大重要課題。
【發明內容】
[0004] 為了克服上述現有技術中出現的問題，本發明提供了一種鹿血清的分離制備方 法，該制備方法簡便快捷，工藝穩定且適于大批量生產，且所得鹿血清能夠用于含血清細胞 培養液的制備。
[0005] 本發明為了解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0006] -種鹿血清的分離制備方法，包括下述步驟：
[0007] (1)采血:將待采血鹿采用消毒液進行鹿體全身清潔消毒處理后，無菌采血法采取 鹿全血至離心瓶內，將離心瓶置于4~5 °C下恒溫靜置5~6h;
[0008] (2)分離:將經（1)處理后的鹿全血在4~5°C的條件下，采用2000~3000rpm的轉速 離心40~50min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置 于-25~-30°C下保存備用，得到冷凍的血清；
[0009] (3)去除纖維蛋白：將經(2)處理所得的冷凍血清置于4~5°C環境中融化，將融化 后所得血清通過多層無菌紗布過濾，收集濾液；
[0010] (4)滅活:將經(3)處理所得濾液置于56~60 °C下恒溫水浴30~40min，水浴過程中 隨時晃動濾液；
[0011] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用層析法將IgG濃度降低 至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為12000~14000的透析膜于0.15~0.18mol/ L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0012] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經（5)處理后的血清采用劑量為30~45KGy 的γ射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內，并用紫外線以45~50°照射該裝 有血清的連續流血漿滅菌器，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液，然后再 將該濾液通過〇. 22~0.25μπι過濾膜過濾，最后經100~150nm過濾膜過濾，得到鹿血清。
[0013] 其進一步的技術方案是：
[0014] 步驟（1)中待采血鹿為身體狀況健康、精神狀態良好、無疫情史的成年鹿、小鹿和 胎鹿中的一種。
[0015] 步驟（1)中采用2wt. %碘酒和75vol. %酒精作為消毒液依次對待采血鹿進行鹿體 全身清潔消毒。
[0016] 步驟(3)中采用八層無菌紗布對融化所得血清進行過濾。
[0017] 步驟⑷中將濾液置于56 °C下恒溫水浴30min。
[0018] 步驟(6)中所述連續流血漿滅菌器的流速為250-270mL/min。
[0019] 本發明還公開了一種上述分離制備方法制備所得的鹿血清。
[0020] 本發明還公開了由上述制備方法制備所得的鹿血清在含血清細胞培養基中的應 用。
[0021] 本發明的有益技術效果是:本發明所述制備方法簡便快捷，工藝穩定且適于大批 量生產，且所得鹿血清不含纖維蛋白，IgG濃度和葡萄糖含量低，能夠徹底杜絕病毒、病菌和 支原體的污染，制備所得的鹿血清能夠用于含血清細胞培養液的制備。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。下述具體實施例中選用未進 食的新生梅花鹿，并檢查鹿體檔案:包括母系年齡、體重、健康狀況、精神狀況、近1年有無疫 情、近1年的疫苗注射情況，并將上述內容登記入待采血鹿的血液檔案。
[0023] 具體實施例一
[0024] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對鹿體進行全身清潔消毒處理，處理結束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于4°C下靜置6h;
[0025] (2)分離：將經（1)處理后的鹿全血在4°C的條件下，采用2000rpm的轉速離心 50min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-25°C下 保存備用，得到冷凍的血清；
[0026] (3)去除纖維蛋白：將經(2)處理所得的冷凍血清置于4°C的冰箱中進行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0027] (4)滅活:將經(3)處理所得濾液置于56°C下嚴格控制水溫條件下恒溫水浴40min， 水浴過程中隨時晃動濾液保持其濾液均勻，避免濾液產生沉淀；
[0028] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用目前常規使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為12000的透析膜于 0.15mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0029] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(5)處理后的血清采用劑量為30KGy的γ 射線照射;然后將上述血清裝入連續流血漿滅菌器內并以45°角度采用紫外線照射，其中連 續流血漿滅菌器的流速為250mL/min，照射同時將血清通過ΕΚ級無石棉蔡氏濾片得到濾液， 將該濾液通過ο. 22μπι過濾膜過濾后，再經過lOOnm過濾膜過濾，得到鹿血清樣品1。將上述制 備所得的鹿血清保存在-20 °C的冰箱中冷凍保存。
[0030] 具體實施例二
[0031 ] (1)采血：將上述選擇好的待采血鹿依次采用濃度為2wt. %的碘酒和濃度為 75vol. %的酒精對鹿體進行全身清潔消毒處理，處理結束后，使用無菌采血針從清潔消毒 后鹿體的靜脈進行全血采集，并將采集到的全血存放在離心瓶中并于5°C下靜置5h;
[0032] (2)分離：將經（1)處理后的鹿全血在5°C的條件下，采用3000rpm的轉速離心 40min，離心結束后在真空環境下從離心瓶中抽取血清，將該抽取所得的血清置于-30°C下 保存備用，得到冷凍的血清；
[0033] (3)去除纖維蛋白：將經(2)處理所得的冷凍血清置于5°C的冰箱中進行融化，將融 化后所得血清通過八層無菌紗布過濾去除纖維蛋白，收集濾液；
[0034] (4)滅活:將經(3)處理所得濾液置于60°C下嚴格控制水溫條件下恒溫水浴30min， 水浴過程中隨時晃動濾液保持其濾液均勻，避免濾液產生沉淀；
[0035] (5)降低IgG濃度和葡萄糖含量:將經(4)處理后的濾液采用目前常規使用的層析 法將IgG濃度降低至小于5μg/ml;然后采用能夠透析蛋白分子量為14000的透析膜在于 0.18mol/L的NaCl水溶液中透析至葡萄糖含量小于0.5mg/ml;
[0036] (6)去除病毒和支原體及除菌過濾:將經(5)處理后的血