11；[11，然后于4°(^下4100印1]1離心10111；[11，棄上清;沉淀用4-511110.IMCaCb重懸，冰上放置 30!11；[11，4°04100印1]1離心10111；[11，棄上清；沉淀用211110.05]\^^1(]12(含15%甘油)
重懸，分裝后-80 °C保存。
[0029]步驟2:將質粒 pGKJE8(購自 Takara，含分子伴侶 Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL)轉入E.Coli BL21感受態細胞，使用含有25yg/ml氯霉素的選擇培養基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氯霉素25yg/ml，瓊脂粉15g/L)挑選轉化菌株，得到攜有分子伴侶質粒的菌株E.Coli BL21-pGKJE8；轉化的具體步驟如下:將裝有200μ1制作好的感受態細胞冰盒上解凍5-10min;加入50-100ng質粒;手指輕彈，混勻，冰上放置30min;42°C，水浴90s，冰浴2min ；加入900ylLB培養基，復蘇細胞，37°C，200rpm，培養Ih。取ΙΟΟμΙ涂布在抗性平板上，37°(:培養箱培養過夜，長出的菌即為轉化成功的菌株。
[0030]步驟3:制備E.Coli BL21-pGKJE8感受態細胞，具體操作參照步驟I。
[0031]步驟4:將構建好的pET28a-cgt表達質粒轉化入E.Coli BL21_pGKJE8感受態細胞，使用含25yg/ml氯霉素和30yg/ml卡那霉素的選擇性培養基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氯霉素25yg/ml，卡那霉素30yg/ml，瓊脂粉15g/L)挑選轉化菌株，。
[0032]實施例3構建的菌株發酵生產環糊精葡萄糖苷轉移酶
種子培養基(g/L):酵母粉5，蛋白胨1，NaCl 1，PH7.0，121°C滅菌15min。
[0033]發酵培養基(g/L):酵母粉24，蛋白胨12，KH2P04 2.31,K2HPO4 16.43，葡萄糖5，121。。滅菌 15min。
[0034]取一環平板上的BL21-pET28a-cgt菌體接種至裝有5ml種子培養基的試管中，200r/min，37°C培養llh。將培養好的種子培養液按照4%(v/v)接種量，接種至裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，200r/min，30°C培養2.5h加IPTG，濃度為ImM，繼續培養至24h。停止發酵后將發酵液經10000r/min離心1min，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，凍融一次，獲得粗酶液。測得酶活為0.61 U/mg DCW。
[0035]實施例4
種子培養基(g/L):酵母粉5，蛋白胨1，NaCl 1，pH7.0，121°C滅菌15min。
[0036]發酵培養基(g/L):酵母粉24，蛋白胨12，KH2P04 2.31,K2HPO4 16.43，葡萄糖5，121。。滅菌 15min。
[0037]取一環平板上的BL21-pET28a-cgt菌體接種至裝有5ml種子培養基的試管中，200r/min，37°C培養llh。將培養好的種子培養液按照4%(v/v)接種量，接種至裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，200r/min，30°C培養2.5h加IPTG，濃度為0.0lmM，繼續培養至24h。停止發酵后將發酵液經10000r/min離心lOmin，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，凍融一次，獲得粗酶液。測得酶活為1.04 U/mg DCW。
[0038]實施例6
種子培養基(g/L):酵母粉5，蛋白胨1，NaCl 1，pH7.0，121°C滅菌15min。
[0039]發酵培養基(g/L):酵母粉24，蛋白胨12，KH2P04 2.31,K2HPO4 16.43，麥芽糖5，121°C 滅菌 15min。
[0040]取一環平板上的BL21-pET28a-cgt菌體接種至裝有5ml種子培養基的試管中，200r/min，37°C培養llh。將培養好的種子培養液按照4%(v/v)接種量，接種至裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，200r/min，30°C培養2.5h加IPTG，濃度為0.0lmM，繼續培養至24h。停止發酵后將發酵液經10000r/min離心lOmin，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得粗酶液。測得酶活為1.58 U/mg DCW。
[0041 ] 實施例7
種子培養基(g/L):酵母粉5，蛋白胨1，NaCl 1，pH7.0，121°C滅菌15min。
[0042]發酵培養基(g/L):酵母粉24，蛋白胨12，KH2P042.31,K2HPO4 16.43，麥芽糖 15，121。。滅菌 15min。
[0043]取一環平板上的BL21-pET28a-cgt菌體接種至裝有5ml種子培養基的試管中，200r/min，37°C培養llh。將培養好的種子培養液按照4%(v/v)接種量，接種至裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，200r/min，30°C培養2.5h加IPTG，濃度為0.0lmM，繼續培養至24h。停止發酵后將發酵液經10000r/min離心lOmin，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得粗酶液。測得酶活為2.00U/mg DCW。
[0044]實施例8
種子培養基(g/L):酵母粉5，蛋白胨1，NaCl 1，pH7.0，121°C滅菌15min。
[0045]發酵培養基(g/L):酵母粉24，蛋白胨12，KH2P042.31,K2HPO4 16.43，麥芽糖 15，121。。滅菌 15min。
[0046]取一環平板上構建好的BL21-pET28a-cgt-pGKJE8菌體接種至裝有5ml種子培養基的試管中，200r/min，37°C培養IIh。將培養好的種子培養液按照4%( v/v)接種量，接種至裝有10mL發酵培養基的500mL三角瓶中，并加入0.5g/L的L-阿拉伯糖和5ng/ml的四環素誘導分子伴侶表達，200r/min，30°C，2.5h，加入0.0ImMIPTG誘導產酶，繼續培養至24h。停止發酵后將發酵液經10000r/min離心1min，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得粗酶液，測得酶活為7.82U/mg DCW。
[0047]實施例9
合成2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸
將10(^/1的1^-抗壞血酸和258/1的0-環糊精溶于?!1為4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，并加入酶活為30U/mL環糊精葡萄糖苷轉移酶粗酶液(發酵液經10000r/min離心lOmin，棄上清，用PH為6.2的磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得粗酶液)，37°C，避光除氧，200r/min，每隔6h加25g/L的β-環糊精，共反應24h，反應結束后加入100U/mL的糖化酶，55°C，200r/min反應24h，2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸產量達到6g/L。
[0048]實施例10 2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸測定方法(HPLCfe)
樣品10000r/min離心I Omin，取上清適度稀釋，0.22μηι超濾膜過濾，進行HPLC分析。條件如下:流動相為ΡΗ2.0的 KH2PO4C0.025Μ):甲醇=99.5:0.5溶液，流速0.5ml/min，柱溫25°C，進樣量5yL。
[0049]雖然本發明已以最佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌是將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因通過載體導入到宿主細胞中得到的，其可將產生的環糊精葡萄糖苷轉移酶留在細胞內；其中所述的載體為質粒載體pET28a。2.權利要求1所述的產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌，其特征在于，所述宿主細胞中導入有含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質粒pGKJE8。3.權利要求2所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將質粒PGKJE8轉入感受態宿主細胞中，挑選出轉化菌株，制成感受態細胞； 2)將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因導入到質粒載體pET28a中，構建得到pET28a-cgt表達質粒，然后轉入感受態細胞中，通過選擇培養基挑選得到基因工程菌。4.權利要求1或2所述的基因工程菌在產環糊精葡萄糖苷轉移酶中的應用。5.權利要求1或2所述的基因工程菌在產2-0-a-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸中的應用。6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，包括如下步驟: 1)將基因工程菌接種至種子培養基，進行種子培養； 2)將步驟I)培養好的種子培養液接種至發酵培養基中，30°C培養2-8h，加IPTG，繼續培養至24h，停止發酵，離心，棄上清，用磷酸緩沖液重懸，超聲，獲得環糊精葡萄糖苷轉移酶粗酶液。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，步驟2)中加入的IPTG濃度為0.0lmM-0.4mM。8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，步驟2)中所述發酵培養基中碳源濃度為5-30g/Lo9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，步驟2)中所述發酵培養基中碳源為麥芽糖。10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，步驟2)中所述發酵培養基中碳源濃度為15g/L0
【專利摘要】本發明公開了一種產環糊精葡萄糖苷轉移酶的基因工程菌及其應用，所述基因工程菌是將環糊精葡萄糖苷轉移酶基因通過載體導入到宿主細胞中得到的，其可將產生的環糊精葡萄糖苷轉移酶留在細胞內；其中所述的載體為質粒載體pET28a。所述宿主細胞中導入有含分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質粒pGKJE8。所述菌株將含有分子伴侶Dnak-DnaJ-GrpE-GroES-GroEL的質粒pGKJE8和pET28a-cgt一并導入宿主細胞中，實現共表達，可以有效提高蛋白的正確折疊率，從而減少包涵體的形成，提高酶的正確表達率，提高酶活。本發明構建的菌株酶活可提高到7.82U/mg？DCW，通過酶活的提高可以有效提高2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸產量。
【IPC分類】C12N9/10, C12N15/70, C12P19/60, C12N1/21, C12R1/19
【公開號】CN105647847
【申請號】
【發明人】馬江鋒, 蔣羽佳, 董維亮, 吳若凡, 陳娟, 高有軍, 吳昊, 姜岷
【申請人】南京工業大學, 常茂生物化學工程股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月17日