用于慢病毒包裝的無血清培養293t細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著免疫細胞治療產業的發展，越來越多的研究機構、醫藥公司和初創公司投身 于免疫細胞治療技術的明星:CAR-T，的研發、臨床試驗和產業化制備。CAR-T全稱嵌合抗原 受體T細胞，是一種利用基因工程的方法設計、合成CAR基因，轉至慢病毒載體，利用293T包 裝為慢病毒，然后感染腫瘤患者的T細胞，從而得到CAR-T細胞，回輸患者，用于腫瘤患者的 免疫細胞治療。由于CAR基因設計了識別腫瘤細胞的單鏈抗體和活化T細胞的胞漿內活化結 構域，因此，CAR-T治療腫瘤具有極好的效果，針對急性淋巴細胞性白血病的完全緩解率達 到了 93%，是一種能夠治愈腫瘤的技術。目前，美國和中國的CAR-T研發非常活躍，中國僅次 于美國申請了關于CAR-T細胞治療的20多項臨床試驗方案，可以說，CAR-T治療正在中國如 火如荼的開展，很有可能開發出治愈腫瘤的細胞治療方案，造福廣大腫瘤患者。
[0003] 在CAR-T的制備過程中，最常用到的基因操作技術是慢病毒包裝技術，需要利用貼 壁培養的293T細胞，通過轉染試劑轉入CAR慢病毒載體和病毒包裝質粒，2天后在細胞培養 上清內得到慢病毒顆粒，此慢病毒為人工包裝的病毒，只具有一次感染能力，可以高效的感 染T細胞，具有其他基因操作技術:轉染、電轉、逆轉錄病毒、腺病毒等無法比擬的優勢，因 此，CAR-T制備過程中慢病毒包裝是必需的過程，在CAR-T產業化和人體應用的過程中，必需 解決如何得到符合GMP標準的慢病毒顆粒的問題。
[0004] 相關技術中，慢病毒包裝主要采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養293T細 胞，慢病毒顆粒制備過程中，不可避免的混入胎牛血清成分，如牛血清白蛋白（BSA)。然而， 依據GMP標準，用于人體的生物制品必須不含動物源性成分，為了解決這一問題，目前通用 的做法是得到慢病毒液后，利用離子交換、灌流的方法去除牛血清，這種方法雖然滿足了牛 血清成分去除的要求，但操作過程復雜，使用的灌流設備和耗材、試劑費用較高，并且采用 此技術濃縮、純化慢病毒的倍數不高，會影響CAR-T后續步驟中的慢病毒感染效率。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。
[0006] 為此，本發明的一個目的在于提出一種用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的 方法，可以解決慢病毒包裝過程中混入牛血清成分的問題，以符合GMP制品要求。
[0007] 根據本發明實施例的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，包括以下步 驟：
[0008] 步驟S1、用含10% (體積比）胎牛血清的DMEM培養基，將293T細胞放在37°C、5%C〇2 的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0009] 步驟S2、用含5% (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S1培養獲得的293T細胞 放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0010] 步驟S3、用含2% (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S2培養獲得的293T細胞 放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0011] 步驟S4、用含1 % (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S3培養獲得的293T細胞 放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0012] 步驟S5、用含0.5%(體積比）胎牛血清的001培養基，將步驟34培養獲得的2931'細 胞放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0013] 步驟S6、用含0.1%(體積比）胎牛血清的001培養基，將步驟35培養獲得的2931'細 胞放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0014] 步驟S7、用含0.05 % (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S6培養獲得的293T細 胞放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿；
[0015] 步驟S8、用CDM培養基，將步驟S7培養獲得的293T細胞放在37°C、5%⑶2的孵箱內 進行培養，直至細胞長滿；由此獲得用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞。
[0016] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S3之前，將步驟S2培養獲得的293T細胞，在步驟S2的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0017] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S4之前，將步驟S3培養獲得的293T細胞，在步驟S3的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0018] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S5之前，將步驟S4培養獲得的293T細胞，在步驟S4的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0019] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S6之前，將步驟S5培養獲得的293T細胞，在步驟S5的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0020] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S7之前，將步驟S6培養獲得的293T細胞，在步驟S6的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0021] 根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S8之前，將步驟S7培養獲得的293T細胞，在步驟S7的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0022]根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S8之后，將步驟S8培養獲得的293T細胞，在步驟S8的培養條件下進行多次傳代培 養的步驟。
[0023]根據本發明的一個示例，所述多次傳代培養的次數均為五次。
[0024]根據本發明的一個示例，所述用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法還包 括在步驟S8之后，將培養獲得的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞進行凍存的步驟。 [0025]根據本發明實施例的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，可以解決相 關技術中慢病毒包裝過程中混入牛血清成分的問題。通過本發明的方法培養得到的293T細 胞能夠在無血清條件下，快速增殖，能夠用于慢病毒的包裝，得到的慢病毒具有較高的滴 度，能夠用于CAR-T制備的產業化要求，解決了使用牛血清不符合GMP制品要求的問題。
【附圖說明】
[0026]圖1示出了無血清⑶Μ條件和親代細胞10 %牛血清培養條件的293T細胞的形態和 增殖速度。
[0027]圖2示出了無血清CDM條件培養的293Τ細胞能夠包裝得到足夠數量的慢病毒。
【具體實施方式】
[0028] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0029] 實施例1
[0030] 步驟S1:用含10% (體積比）胎牛血清的DMEM培養基，將293Τ細胞放在37°C、5%C02 的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。
[0031 ]步驟S2 :用含5 % (體積比）胎牛血清的CDM培養基（步驟2中，將培養基更換為 Pro293a-⑶M，簡稱⑶Μ培養基，這是一種無血清的293細胞培養基，L0NZA公司，貨號：12-764Q)，將步驟S1培養獲得的293Τ細胞放在37 °C、5 %⑶2的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。 此時，細胞形態和增殖速度沒有發生明顯改變。
[0032]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后(傳代5次約需10-12天時間）， 對部分細胞取樣凍存。
[0033] 步驟S3、用含2% (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S2培養獲得的293T細胞 放在37°C、5%C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。此時，細胞少部分死亡，增殖速度明顯 減慢。
[0034]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后(傳代5次約需15-20天時間）， 對部分細胞取樣凍存。可以看出，由于細胞少部分死亡，增殖速度明顯減慢，傳代間隔時間 延長(時間范圍約3-4天/傳代）。
[0035]步驟S4、用含1 % (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S3培養獲得的293T細胞 放在37 °C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。此時，細胞無明顯變化，增殖速度亦無 明顯變化。
[0036]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后(傳代5次約需15-20天時間）， 對部分細胞取樣凍存。
[0037] 步驟S5、用含0.5%(體積比）胎牛血清的001培養基，將步驟34培養獲得的2931'細 胞放在37 °C、5 %C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。此時，細胞形態變圓，貼壁不緊，部 分細胞變為懸浮生長，增殖速度減慢。
[0038]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后（傳代5次約共需25-30天時 間）。傳代培養時，需要丟棄懸浮細胞，保留貼壁細胞，對部分細胞取樣凍存。
[0039] 步驟S6、用含0.1%(體積比）胎牛血清的001培養基，將步驟35培養獲得的2931'細 胞放在37 °C、5 % C02