的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。此時，約有一半細胞懸浮，一半細胞 貼壁，貼壁細胞貼壁不緊牢，增殖速度減慢。
[0040]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后(約6-8天/傳代，約共需30-40 天時間），對部分細胞取樣凍存。
[0041 ] 步驟S7、用含0.05 % (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S6培養獲得的293T細 胞放在37 °C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿。此時，細胞增殖速度無明顯變化，但 貼壁逐漸較緊。
[0042]有序地，細胞長滿后，進行傳代培養，連續傳代5次后（約共需30-40天時間），對部 分細胞取樣凍存。
[0043] 步驟S8、用CDM培養基，將步驟S7培養獲得的293T細胞放在37°C、5%⑶2的孵箱內 進行培養，直至細胞長滿；由此獲得用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞。
[0044] 由上述可知，經過持續不斷的培養，馴化(整個培養過程約需60-80天時間），在無 血清CDM條件下培養的293T細胞增殖速度逐漸較快。至此，可以得到馴化成功、能夠在無血 清條件下培養的293T細胞。
[0045] 圖1示出了無血清⑶Μ條件和親代細胞10 %牛血清培養條件的293T細胞的形態和 增殖速度。
[0046] 其中，在圖1中，
[0047] Α示出了含血清條件(DMEM/10%FBS)下的293Τ細胞；
[0048] B示出了無血清條件(使用無血清培養基，Pro293a-CDM)下的293T細胞；
[0049] C示出了 MTS法測定兩種生長條件下293T細胞的增殖速度，無血清條件下培養前兩 天細胞之間生長速度無差異，后兩天無血清條件下生長速度變慢。
[0050] 對比例
[00511使用無血清培養的293T細胞包裝慢病毒，我們對包裝慢病毒的條件和上清中是否 含有足夠數量的慢病毒進行了實驗。
[0052]具體實驗方案見下：
[0053] 1.病毒包裝條件的優化
[0054] 1.1種細胞:種植1 X 106293T細胞/孔(6孔板），共3孔，使用無血清培養條件；
[0055] 1.2轉染，過夜培養后，顯微鏡下觀察，細胞密度約80 % -90 %，設計不同的轉染條 件，以確定得到最佳轉染效率，病毒包裝效率較高，轉染條件和分組見下表1。
[0056] 表1分組和轉染條件、步驟
[0057]
[0058] 1.3轉染2天后，收獲培養基病毒上清，1500rpm室溫離心5分鐘，取上清測定病毒含 量。
[0059] 2.培養上清病毒的檢測
[0060] 2.1種細胞1 X 104293T細胞/孔(96孔板），共種植6孔；
[0061] 2.2過夜培養后，細胞密度約50%-60%，取1.3收獲的病毒上清50μ1，加入96孔板 的6孔內，A、B、C每種病毒上清各設一復孔；
[0062] 2.3感染3天后，觀察熒光(包裝的病毒載體？1^-11^5-?1^〇含綠色熒光），照相，圖 片見下圖2。
[0063] 圖2示出了不同轉染包裝條件得到的病毒量比較。
[0064] 其中，A表示表1中轉染分組A包裝的病毒；
[0065] B表示表1中轉染分組B包裝的病毒；
[0066] C表示表1中轉染分組C包裝的病毒；
[0067] D表示使用含10%血清培養的293T細胞包裝的病毒。
[0068]圖2中，綠色熒光點表示病毒成功感染了293T，綠色熒光點多表明病毒數量較多， 可見C轉染包裝條件得到病毒量較多，A、B轉染條件病毒量非常少。C和D相比，熒光點數量區 別不大，表明無血清條件培養的細胞能夠包裝出高質量的病毒。
[0069]結果表明，轉染條件C包裝病毒的效果較好。這些結果表明，采用本發明所培養得 到的無血清培養293T能夠高效的包裝得到慢病毒顆粒，將可以用于包裝符合GMP標準的 CAR-T用慢病毒。
[0070] 根據本發明實施例的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，可以解決相 關技術中慢病毒包裝過程中混入牛血清成分的問題。通過本發明的方法培養得到的293T細 胞能夠在無血清條件下，快速增殖，能夠用于慢病毒的包裝，得到的慢病毒具有較高的滴 度，能夠用于CAR-T制備的產業化要求，解決了使用牛血清不符合GMP制品要求的問題。
[0071] 相關技術建立了無血清條件培養的293T細胞，但293T細胞為懸浮細胞，主要應用 于生物工程中蛋白質的高效表達，不能用于慢病毒包裝。本發明建立了貼壁的無血清培養 的293T細胞。使用無血清培養包裝的慢病毒，在后續的濃縮、純化過程中，可以不使用昂貴 的灌流設備和耗材，慢病毒濃縮倍數更高，從而能夠高效感染T細胞。
[0072] 盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述 實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1. 一種用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟S1、用含10% (體積比）胎牛血清的DMEM培養基，將293T細胞放在37°C、5%⑶2的孵 箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S2、用含5% (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S1培養獲得的293T細胞放在 37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S3、用含2% (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S2培養獲得的293T細胞放在 37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S4、用含1 % (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S3培養獲得的293T細胞放在 37°C、5 % C02的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S5、用含0.5 % (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S4培養獲得的293T細胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S6、用含0.1 % (體積比）胎牛血清的⑶Μ培養基，將步驟S5培養獲得的293T細胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S7、用含0.05 % (體積比）胎牛血清的CDM培養基，將步驟S6培養獲得的293T細胞放 在37°C、5 % 0)2的孵箱內進行培養，直至細胞長滿； 步驟S8、用CDM培養基，將步驟S7培養獲得的293T細胞放在37°C、5 % C02的孵箱內進行培 養，直至細胞長滿；由此獲得用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞。2. 根據權利要求1所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S3之前，將步驟S2培養獲得的293T細胞，在步驟S2的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。3. 根據權利要求2所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S4之前，將步驟S3培養獲得的293T細胞，在步驟S3的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。4. 根據權利要求3所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S5之前，將步驟S4培養獲得的293T細胞，在步驟S4的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。5. 根據權利要求4所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S6之前，將步驟S5培養獲得的293T細胞，在步驟S5的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。6. 根據權利要求5所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S7之前，將步驟S6培養獲得的293T細胞，在步驟S6的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。7. 根據權利要求6所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S8之前，將步驟S7培養獲得的293T細胞，在步驟S7的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。8. 根據權利要求7所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 還包括在步驟S8之后，將步驟S8培養獲得的293T細胞，在步驟S8的培養條件下進行多次傳 代培養的步驟。9. 根據權利要求8所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在于， 所述多次傳代培養的次數均為五次。10.根據權利要求1所述的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，其特征在 于，還包括在步驟S8之后，將培養獲得的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞進行凍存 的步驟。
【專利摘要】本發明提出一種用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，包括在37℃、5％CO2的孵箱內，依次用含10％(體積比)胎牛血清的DMEM培養基、用含5％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用含2％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用含1％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用含0.5％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用含0.1％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用含0.05％(體積比)胎牛血清的CDM培養基、用CDM培養基，對前步獲得的293T細胞進行培養，直至獲得用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞。根據本發明實施例的用于慢病毒包裝的無血清培養293T細胞的方法，可以解決慢病毒包裝過程中混入牛血清成分的問題，符合GMP制品要求。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105647852
【申請號】
【發明人】何昱, 栗紅建, 何嶸, 姜冬冬
【申請人】北京普瑞金科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月30日