子獲能，精子計數后吸取1 X 106左右的獲能精子至盛有卵母細 胞的HTF液中，進行受精4~6h。
[0023] 2、體外培養
[0024] 對照組:用平衡好的小鼠胚胎培養液KS0M+AA充分洗滌受精卵，移入預先平衡好的 KS0M+AA培養液滴中繼續培養，每30枚胚胎放入60μ1培養微滴中，置于37°C、5%C02、飽和濕 度的C0 2培養箱中培養88-90h，發育到囊胚。
[0025] 實驗組：用平衡好的小鼠胚胎培養液KS0M+AA充分洗滌受精卵，移入預先平衡好 的，添加有5nM視黃酸的KS0M+AA培養液微滴中37 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養箱中避光培 養36h，然后移入不含有視黃酸的培養液KS0M+AA中，于37°C、5 %⑶2、飽和濕度的C02培養箱 中繼續培養52-54h，發育到囊胚。
[0026]其中，添加有5nM視黃酸的培養液KS0M+AA的制備方法如下：在避光條件下用DMS0 將視黃酸配制成〇. ImM濃儲，10μ1/管分裝后-20°C保存;視黃酸添加培養液需要現配現用， 使用前，避光條件下，吸取1〇μ1 KS0M+AA液加入濃儲管中，混勻后，得混合液I，吸取10μ1混 合液I加入990μ1 KS0M+AA液中，繼續混勻，得混合液Π ，再吸取20μ1混合液Π 加入1980μ1 KS0M+AA液中，混勻后，即得添加有5ηΜ視黃酸的培養液KS0M+AA。用于制作培養微滴。上述反 復稀釋操作，不僅能確保視黃酸添加濃度的精確，而且可減少DMS0在培養液中的殘留。
[0027] 3、囊胚子宮移植
[0028] 挑取自然發情的8周的ICR雌性小鼠與結扎雄鼠合籠，次日上午檢栓。有栓的雌鼠 用于移植，檢栓的當天為妊娠第1天(D1)，移植在D4上午8:00-11:00進行。移植時假孕鼠腹 腔注射麻醉劑(Sigma公司，三溴乙醇，T48402)0.4ml，待小鼠麻醉后，手術部位局部剪毛、消 毒，用外科剪刀在小鼠背部脊柱靠近最后1根肋骨后緣處作一開口，用鑷子撕開肌層及腹膜 暴露腹腔臟器，用鑷子夾住卵巢脂肪墊將卵巢、輸卵管及部分子宮拉出體外，用脂肪夾固 定。用注射器針頭在子宮角末端刺一小孔定位，用移植針吸取M2液中的囊胚，沿小孔插入， 上下輕輕移動移植針，在確定移植針的針尖在子宮角內時，緩緩將胚胎注入。每側子宮角移 植6枚胚胎。
[0029] 4、實驗結果
[0030] 本實施例中，小鼠胚胎經5nM視黃酸處理36h后，囊胚率沒有明顯變化（對照組： 67.3 % ± 2.8 % ;添加組:64.5%±2.2%)，而且囊胚的內細胞團/滋養層細胞數的比值不存 在顯著變化(對照組：2.54±0.61;添加組:2.50±0.58)，這表明囊胚的發育潛能沒有受到 破壞。此外，與對照組相比，小鼠囊胚的性別比例也沒有受到明顯的影響（對照組的雄/雌： 1.01(n = 524);添加組的雄/雌：1.03(n = 262))。以上結果表明采用視黃酸處理對IVF胚胎 的發育沒有副作用。
[0031]獲得的囊胚進行子宮移植后，添加組胎兒發育異常比例顯著降低（對照組： 10.1%;添加組:4.2%);圍產期存活胎兒的性別比例得到顯著改善，對照組的雄/雌：1.34 (n = 502);添加組的雄/雌：1.08(n = 296)。這些結果表明視黃酸處理能夠改善附植后小鼠 雌性胎兒的發育質量。
[0032]實施例2牛體外受精胚胎生產 [0033] 1、體外受精
[0034]將通過激素超數排卵獲得的成熟ΜΠ 期卵母細胞在受精液(B0液+10mM咖啡因+ 3mg/ml BSA)中清洗3次后放入平衡好的50μ1受精液微滴中（15枚/滴）；采用上浮法進行精 子獲能，精子在洗精液(Β0液+20μg/ml肝素鈉+6mg/ml BSA)上浮20-30min，之后取上清600-800μ1放入1.5ml離心管離心（1500轉，離心5min)，棄上清，重復清洗1次。離心后除去上清， 再加入洗精液，精子計數，然后取50μ1處理后的精液加入已放入卵母細胞的受精液中，精子 終濃度為1 X 1 〇6精子/ml，培養條件為39 °C、5 % C02，飽和濕度，受精時間8h。
[0035] 2、體外培養
[0036] 對照組:受精卵在平衡好的前期發育液(CR1液+6mg/ml BSA，2ml)中洗滌3次后采 用四孔板兩步法培養:首先在500μ1前期發育液(50枚左右）中培養2d，計數卵裂胚胎后移入 500μ1后期發育液(CR1液+10%FBS)中培養5d，間隔2d半量換液，胚胎發育第7天計數囊胚。 培養條件為39 °C、5 % C02，飽和濕度，培養時間7d。
[0037]實驗組:受精卵在平衡好的前期發育液(CR1液+6mg/ml BSA，2ml)中洗滌3次后采 用四孔板兩步法培養:首先在添加20nM視黃酸的500μ1前期發育液(50枚左右）中避光培養 48h，然后將卵裂胚胎移入添加20ηΜ視黃酸的500μ1后期發育液(CR1液+10%FBS)中避光培 養36h，再將所有胚胎移入不添加視黃酸的500μ1后期發育液(CR1液+10%FBS)中繼續培養 3.5d，胚胎發育第7天計數囊胚。培養條件為5%C0 2的空氣，溫度39°C，飽和濕度。
[0038] 3、實驗結果
[0039] 通過PCR鑒定后，對性別進行相關統計(表1)，結果與對照組相比，實驗組雄性囊胚 占總的卵裂胚胎的比例沒有顯著變化(P>〇.05);實驗組雌性囊胚占總的卵裂胚胎的比例顯 著升高(P〈0.05)。此外，囊胚的性別比例得到顯著改善。
[0040] 表1視黃酸處理對牛IVF囊胚發育情況的統計
[0041]
[0042] 注:a、b表示差異顯著(P〈0.05) 性別比例是與期望值（1.00)相比較的結果，方法 為卡方檢驗(*P〈〇.〇5)。
[0043] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 視黃酸在改善體外受精雌性胚胎附植后發育質量中的應用。2. -種改善體外受精雌性胚胎附植后發育質量的方法，其特征在于，將通過IVF技術獲 得的受精卵移入添加有1_50ηΜ視黃酸的培養液中進行培養，發育到囊胚，再移植到母體子 宮內，發育形成胎兒。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，其是通過激素超數排卵獲取哺乳動物Μ Π 期卵母細胞，然后進行體外受精獲得受精卵。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，將通過IVF技術獲得的小鼠受精卵移入添 加有1-20ηΜ視黃酸的培養液KSOM+AA中，于37°C、5% C02、飽和濕度的C02培養箱中避光培養 24-48h，然后移入不含有視黃酸的培養液KSOM+AA中，于37°C、5 % C02、飽和濕度的C02培養 箱中繼續培養，發育到囊胚。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將通過IVF技術獲得的小鼠受精卵移入添 加有5nM視黃酸的培養液KSOM+AA中，于37°C、5%⑶ 2、飽和濕度的⑶2培養箱中避光培養 36h，然后移入不含有視黃酸的培養液KSOM+AA，于37°C、5 % C02、飽和濕度的C02培養箱中繼 續培養52-54h，發育到囊胚。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述添加有5nM視黃酸的培養液KSOM+AA的 制備方法如下： 在避光條件下用DMSO將視黃酸配制成0.1 mM濃儲，ΙΟμΙ/管分裝后-20°C保存;視黃酸添 加培養液需要現配現用，使用前，避光條件下，吸取1〇μ1 KSOM+AA液加入濃儲管中，混勻后， 得混合液I，吸取1〇μ1混合液I加入990μ1 KSOM+AA液中，繼續混勻，得混合液Π ，再吸取20μ1 混合液Π 加入1980μ 1 KSOM+AA液中，混勻后，即得添加有5ηΜ視黃酸的培養液KSOM+AA。7. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，將通過IVF技術獲得的牛受精卵移入添加 有5-50nM視黃酸的前期發育液中，于39°C、5% C02、飽和濕度的C02培養箱中避光培養48h， 再移入添加有5-50nM視黃酸的后期發育液中，于39°C、5% C02、飽和濕度的C02培養箱中避 光培養24-48h，然后移入不含有視黃酸的后期發育液中，于39°C、5% C02、飽和濕度的C02培 養箱中繼續培養，發育到囊胚； 所述前期發育液為CR1液+6mg/ml BSA;所述后期發育液為CR1液+10% FBS。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，將通過IVF技術獲得的牛受精卵移入添加 有20nM視黃酸的前期發育液中，于39°C、5% C02、飽和濕度的C02培養箱中避光培養48h，再 移入添加有20nM視黃酸的后期發育液中，于39°C、5%⑶ 2、飽和濕度的⑶2培養箱中避光培 養36h，然后移入不含有視黃酸的后期發育液中，于39°C、5 % C02、飽和濕度的⑶2培養箱中 繼續培養3.5d，發育到囊胚。
【專利摘要】本發明提供了一種改善體外受精(IVF)雌性胚胎附植后發育質量及校正IVF胚胎性別比例的方法。本發明將通過IVF技術獲得的小鼠受精卵移入添加有低劑量的視黃酸(RA)的培養液中進行短期培養，以此改善IVF胚胎早期發育中的雌性特異的表觀修飾事件(即X染色體失活)的正常建立，從而減少小鼠IVF雌性胚胎附植后的異常發育比例，最終校正小鼠IVF出生性別比例失衡問題。此外，本發明成功在牛IVF體系中應用，有效提高了牛IVF雌性囊胚的發育率，校正了牛IVF囊胚的性別比例。本發明中RA作為輸卵管廣泛表達的內源活性物質，在IVF體系中適量添加該物質而不是盲目的添加外源成分，極大程度地確保了應用方面的安全性。
【IPC分類】C12N5/073
【公開號】CN105647853
【申請號】
【發明人】田見暉, 譚琨, 安磊, 吳中紅, 郭敏
【申請人】中國農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月1日