一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于體外授精技術領域，尤其涉及一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法。
【背景技術】
[0002]體外授精是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環境中完成授精過程的技術，英文簡稱為工VF。由于它與胚胎移植技術(ET)密不可分，又簡稱為IVF-ET。在生物學中，把體外授精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物。人工授精技術是一項應用于哺乳動物的繁育高新技術。利用人工授精，結合胚胎移植技術，可以開發遺傳特性優良的母畜繁殖潛力，較快地擴大良種畜群，在自然情況下，牛、馬等母畜通常一年產I胎，一生繁殖后代僅僅16只左右;豬也不過百頭。采用人工授精技術，結合胚胎移植技術則使優良母畜免去了冗長的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次發情、配種和授精，從而能在一定時間內產生較多的后代。目前在許多畜牧業發達國家人工授精和胚胎移植均已進入產業化發展階段。在我國，這一技術起步較晚，我國從七十年代開始對胚胎生物工程技術進行研究，八十年代后發展迅速。先后采用胚胎人工授精技術成功對奶牛、波爾山羊進行擴繁。
[0003]已有的研究報道中，體外授精技術的改善主要集中在精子獲能液和授精液的配方上，還沒有對于整個體系的改善的相關報道，而且現有技術的體外授精授精率率較低。因此開發出一種能改善體外授精的體系，以提高精子活力，增加體外授精的效率具有重要的生產意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是解決上述技術問題，提供一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法。
[0005]為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，包括以下步驟:
[0006](I)將睪丸支持細胞分離培養2天，細胞單層形成，在進行體外授精前12h棄去舊培養基，用PBS洗I次，加入含1%FBS、1%PS的a-MEM培養基，將培養皿置于37°C、5%C02的培養箱中過夜培養平衡，同時將HTF精子獲能液也放入37 °C、5 % CO2的培養箱過夜平衡；
[0007](2)獲取精子后，將精子導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5%⑶2培養箱內孵育Ih;
[0008](3)卵子的收集:收集出卵丘卵母細胞復合體；
[0009](4)用透明質酸酶消化卵子周圍的卵丘細胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉入已平衡的有睪丸支持細胞單層的培養基；
[0010](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養液中，精子濃度為2-4 X 16 個/ml;
[0011](6)將培養皿放回37°C、5%CO2培養箱孵育，保持5-6h；
[0012](7)將有第二極體和原核的卵從培養基中撿選出來，用培養基洗2次，然后轉入胚胎培養基中進行培養。
[0013]優選地，所述步驟(2)的具體操作為:將成熟雄性動物處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團，把精子團導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養箱內孵育Ih。
[0014]進一步地，所述成熟雄性動物可以為成熟公鼠，將成熟公鼠處死的方法為用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死。
[0015]優選地，所述步驟(3)的具體操作為:
[0016]a、對成熟雌性動物以48h為間隔注射5IU的PMSG和5IU的hCG，誘發排卵；
[0017]b JMhCG 14h后用將成熟雌性動物處死，立即開腹，取出輸卵管；
[0018]C、把輸卵管放入培養皿中，用解剖針撕開膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細胞復合體。
[0019]進一步地，所述成熟雌性動物可以為成熟母鼠，將成熟母鼠處死的方法為用勁椎脫臼法將成熟母鼠處死。
[0020]優選地，步驟(5)中，精子濃度為3X 16個/ml。
[0021]需要注意的是，本發明所有步驟中所用到的器械均必須經過高溫高壓滅菌消毒(121°C,20-30min)o
[0022]現有技術中，對于體外授精技術的研究工作一直集中在改變培養液的配方或授精機制的研究等方面，而從未涉及到體外授精體系的改善，本發明建立的體外授精技術改善了體外授精的微環境，進而改善了體外授精的體系，采取以睪丸支持細胞為滋養層建立體夕卜授精體系，增加了精子活力，提高了體外授精的授精率和效率。
[0023]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明的技術方案能有效地提高體外授精的效率，本發明利用SC作為滋養層，通過改變培養體系的微環境達到了提高授精率和發育率的效果，實驗結果表明，采用本發明的技術方案的授精率達89.2%以上，由于本發明提高了授精卵的發育率，因此降低了產業化應用的生產成本，提高了精子和卵子的利用價值。
【具體實施方式】
[0024]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0025]實施例1
[0026]本實施例為實驗組，實驗組的處理如下:
[0027]—種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，包括以下步驟:
[0028](I)將睪丸支持細胞分離培養2天，細胞單層形成，在進行體外授精前12h棄去舊培養基，用PBS洗I次，加入含1%FBS、1%PS的a-MEM培養基，將培養皿置于37°C、5%C02的培養箱中過夜培養平衡，同時將HTF精子獲能液也放入37 °C、5 % CO2的培養箱過夜平衡；
[0029](2)用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團，把精子團導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養箱內孵育Ih;
[0030](3)卵子的收集:[0031 ] a、對成熟母鼠注射5IU的PMSG，48h后注射5IU的hCG，誘發排卵；
[0032]b、注射hCG 14h后用勁椎脫臼法處死成熟母鼠，立即開腹，取出輸卵管；
[0033]C、把輸卵管放入培養皿中，用解剖針撕開膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細胞復合體。
[0034](4)用透明質酸酶消化卵子周圍的卵丘細胞，洗滌3次后