，將洗滌過的卵子轉入步驟(I)所得的已平衡的有睪丸支持細胞單層的培養基；
[0035](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養液中，精子濃度為
3X 16 個/ml;
[0036](6)將培養皿放回37 °C、5 % CO2培養箱孵育，保持5_6h ；
[0037](7)將有第二極體和原核的卵從培養基中撿選出來，用培養基洗2次，然后轉入培養基中進行培養。
[0038]實施例2
[0039]本實施例為對照組的【具體實施方式】，對照組的處理如下:
[0040](I)在沒有支持細胞單層的35mm的培養皿中加入含I %FBS、I %PS的a-MEM培養基，將培養皿置于37°C,5%⑶2的培養箱中過夜培養平衡，同時將HTF精子獲能液也放入37°C、5% CO2的培養箱過夜平衡；
[0041](2)用勁椎脫臼法將成熟公鼠處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團，把精子團導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養箱內孵育Ih;
[0042](3)卵子的收集:
[0043]a、對成熟母鼠注射5IU的PMSG，48h后注射5IU的hCG，誘發排卵；
[0044]b、注射hCG 14h后用勁椎脫臼法處死成熟母鼠，立即開腹，取出輸卵管；
[0045]C、把輸卵管放入培養皿中，用解剖針撕開膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細胞復合體。
[0046](4)用透明質酸酶消化卵子周圍的卵丘細胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉入步驟(I)所得的已平衡的沒有睪丸支持細胞單層的培養基中；
[0047](5)將20ul步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養液中，精子濃度為
3X 16 個/ml;
[0048](6)將培養皿放回37 °C、5 % CO2培養箱孵育，保持5_6h ；
[0049](7)將有第二極體和原核的卵從培養基中撿選出來，用培養基洗2次，然后轉入培養基中進行培養。
[0050]需要注意的是，本發明所有步驟中所用到的器械均必須經過高溫高壓滅菌消毒(121°C,20-30min)o
[0051]本發明的技術方案能有效地提高體外授精的效率，本發明利用SC作為滋養層，通過改變培養體系的微環境達到了提高授精率和發育率的效果，實驗結果表明，采用本發明的技術方案的授精率達89.2%以上，由于本發明提高了授精卵的發育率，因此降低了產業化應用的生產成本，提高了精子和卵子的利用價值。
[0052]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將睪丸支持細胞分離培養2天，細胞單層形成，在進行體外受精前12h棄去舊培養基，用I3BS洗I次，加入含I %FBS、I %PS的a-MEM培養基，將培養皿置于37°C、5%C02的培養箱中過夜培養平衡，同時將HTF精子獲能液也放入37°C、5 % CO2的培養箱過夜平衡； (2)獲取精子后，將精子導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % C02培養箱內孵育Ih; (3)卵子的收集:收集出卵丘卵母細胞復合體； (4)用透明質酸酶消化卵子周圍的卵丘細胞，洗滌3次后，將洗滌過的卵子轉入已平衡的有睪丸支持細胞單層的培養基； (5)將20uI步驟(2)所孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養液中，精子濃度為2-4X 16 個/ml; (6)將培養皿放回37°C、5 % CO2培養箱孵育，保持5-6h; (7)將有第二極體和原核的卵從培養基中撿選出來，用培養基洗2次，然后轉入培養基中進行培養。2.根據權利要求1所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:所述步驟(2)的具體操作為:將成熟雄性動物處死，立即摘出睪丸和附睪，在滅菌濾紙上除去血液和脂肪組織，用眼科剪刀剪開附睪尾，取出精子團，把精子團導入盛有已平衡好的HTF獲能液中，在37°C、5 % CO2培養箱內孵育Ih。3.根據權利要求2所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:所述成熟雄性動物為成熟公鼠。4.根據權利要求3所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:將成熟公鼠處死的方法為用勁椎脫白法將成熟公鼠處死。5.根據權利要求1所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:所述步驟(3)的具體操作為: a、對成熟雌性動物以48h為間隔注射5IU的PMSG和5IU的hCG，誘發排卵； b、注射hCG14h后用將成熟雌性動物處死，立即開腹，取出輸卵管； c、把輸卵管放入培養皿中，用解剖針撕開膨大的壺腹部，釋放出卵丘卵母細胞復合體。6.根據權利要求5所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:所述成熟雌性動物為成熟母鼠。7.根據權利要求6所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:將成熟母鼠處死的方法為用勁椎脫白法將成熟母鼠處死。8.根據權利要求1所述的以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，其特征在于:步驟(5)中，精子濃度為3 X 16個/ml。
【專利摘要】本發明涉及一種以睪丸支持細胞為滋養層進行體外授精的方法，包括以下步驟：(1)將睪丸支持細胞的分離培養，制備支持細胞滋養層；(2)將精子導入盛有已平衡好的HTF獲能液中孵育1h；(3)卵子的收集；(4)將洗滌過的卵子轉入已平衡的有睪丸支持細胞單層的培養基；(5)將20ul孵育好的精子懸浮液加到含有卵子的培養液中；(6)將培養皿放回37℃、5％CO2培養箱孵育，保持5-6h；(7)將有第二極體和原核的卵從培養基中撿選出來，轉入培養基中進行培養。本發明的優點是授精率和發育率高。
【IPC分類】C12N5/073, C12N5/075, C12N5/076
【公開號】CN105647854
【申請號】
【發明人】董煥聲, 王明明, 潘慶杰
【申請人】青島農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月5日