一種新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于成體干細胞研究技術領域，更具體地，本發明涉及一種新生仔豬睪丸 生殖干細胞的高效獲取方法。
【背景技術】
[0002] 雄性生殖干細胞(male germline stem cells，mGSCs)是一類存在雄性動物睪丸 中具有維持自我更新保持自身恒定和源源不斷分化精子繁衍后代的干細胞。新生動物睪丸 組織內存在多種類型的細胞(生殖細胞、間質細胞、支持細胞、類肌細胞、血管和淋巴管上皮 細胞、血細胞和淋巴細胞），新生動物睪丸組織內多種細胞都呈現未分化的狀態，相對集中 的呈現出各種具有干性的細胞，如mGSCs和間質干細胞(stem 1 eydig ce 11 s，SLCs)，這時還 并未出現分化的生殖細胞和間質細胞，這個時期對于富集mGSCs優于其他時期。
[0003]未成熟的支持細胞、類肌細胞、間質細胞和血管和淋巴管上皮細胞等成纖維樣生 長的細胞，表現出增殖和貼壁能力強，利用體外差速貼壁法可以去除，Percoll密度梯度離 心的方法是有效的將淋巴細胞、血細胞和成體細胞分開的方法，這些分離措施雖然早已應 用到mGSCs分離中，但以往利用這些方法獲取mGSCs的純度并不高。
[0004] 對于傳統分離方法，通過免疫學建立起來的免疫磁珠和流式分離方法，更多的應 用到成體干細胞分離中，但是一個目前主要的瓶頸是成體干細胞并未發現一種特異的分子 標記，特別是特異的膜表面標記，很多早先報道特異膜表面標記先后被證實并不呈現一種 特異的狀態，早先證實GFRA1，THY-1和PGP9.5等一系列膜表面標記特異表達在mGSCs上，但 結果在使用這些膜表面分子標記分選人和家畜的mGSCs，卻發現結果中的細胞存在大量的 間質細胞;證明了這些標記可能也表達在間質細胞上。目前，利用免疫學分離方法還并不能 有效的實現大動物和人的生殖干細胞的純化。
[0005] 雖然mGSCs研究已開展多年，但是人和家畜mGSCs體外體系仍然未建立成功，目前 僅存在嚙齒動物的mGSCs系，這和細胞純度和生物性質等有直接關系。其中細胞純度對于培 養和后期細胞生物學研究至關重要。成體干細胞數量少，分布廣，分離難，是制約研究和應 用的主要問題。而人和家畜的mGSCs體系未建立成功，這和不完善的分離方法存在直接關 系。細胞系是研究細胞生物學性質和藥物篩選的重要材料，獲得高純度單一種類細胞是建 立細胞系的首要基礎。
【發明內容】
[0006] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種新生仔豬睪丸生殖干 細胞的高效獲取方法，該方法簡化了操作步驟，優化了純化效率，提高了重復性，提高了分 離細胞的純度。
[0007] 為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：
[0008] (1)、通過胰蛋白酶和膠原蛋白的兩步酶消化法獲得新生仔豬的睪丸組織單細胞 懸液；
[0009] (2)、利用差速貼壁法將睪丸組織中貼壁能力強的成纖維類的細胞貼壁而被去除；
[0010] (3)、差速貼壁5次以后，基本都是不貼壁的細胞時，收集這些未貼壁細胞，所述未 貼壁細胞中含有淋巴細胞、紅細胞和生殖干細胞；
[0011] (4)、利用Percoll密度梯度離心方法將密度不同的淋巴細胞和紅細胞與生殖干細 胞分離，即得純的生殖干細胞。
[0012]在其中一些實施例中，步驟（1)中所述胰蛋白酶的濃度為〇. 25wt%，所述膠原蛋白 酶的濃度lmg/mL。
[0013] 在其中一些實施例中，步驟(2)中所述差速貼壁法中所用的多聚賴氨酸的濃度為 0.1mg/ml，可以高效短時間的去除貼壁能力強的睪丸成纖維細胞。
[0014] 在其中一些實施例中，步驟(3)中所述差速貼壁的次數為5次，基本上去除掉了成 纖維類的貼壁細胞。
[0015] 在其中一些實施例中，步驟(4)中所述密度梯度離心方法為:配置20 %和40%兩個 梯度的Percoll離心液，底層加入40 %Percoll液，上層加入20 %的Percoll液，離心后， mGSCs處于40%Perc〇ll液頂部，也就是20%的Percoll液底部，而紅細胞離心后處于離心管 底部，淋巴和細胞碎片在20%P erc〇ll液面頂部，達到分離的目的。
[0016] 在其中一些實施例中，步驟（1)中所述睪丸組織為去掉了脂肪墊白膜和結締組織 的睪丸組織。
[0017] 在其中一些實施例中，所述新生仔豬為1~5天的新生仔豬。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0019] 1、本發明結合傳統的差速貼壁法和密度梯度離心方法，摸索了不同時間點、處理 方法和濃度，通過大量試驗和優化，將含有多種類型細胞的新生仔豬睪丸組織中的mGSCs分 離出來，在原有的分離方法基礎上，優化建立起一套有效的新生仔豬mGSCs的分離純化方 法，操作簡單，重復性好，成功率高，對比以往的分離方法具有明顯優勢，這種方法獲取的 mGSCs展現出形態均一，折光性好，流式檢測結果顯示純度達到85%以上，達到了細胞培養 的要求，高效的獲取高比例的mGSCs，對于后期研究mGSCs性質及其應用具有重要作用。
[0020] 2、本發明的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法不僅可應用于豬雄性生殖 干細胞生物學性質研究的科研平臺、也可以在豬雄性生殖干細胞介導的動物育種、品種改 良和瀕危品種保存等方面具有潛在的應用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發明實施例1的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法的路線圖；
[0022] 圖2是本發明實施例1的新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法的模式圖；
[0023]圖3是本發明實施例1中差速貼壁法獲取高純度mGSCs過程中的細胞狀態圖，其中， A:單細胞懸液;B:貼壁的成纖維樣細胞;C:未貼壁的細胞;D:淋巴細胞和細胞碎片;E:紅細 胞;F:純化的生殖干細胞;G:堿性磷酸酶染色；
[0024] 圖4為本發明實施例2中流式細胞術分析新分離mGSCs的純度的分析結果；
[0025] 圖5為本發明實施例3中對生殖干細胞的組織化學染色與免疫熒光檢測結果圖；其 中，A:純化后豬mGSCs免疫熒光染色;B:原位組織化學染色；
[0026] 圖6為本發明實施例4中對生殖干細胞的生殖標記檢測和分析結果，其中，A:RT_ PCR檢測;B:蛋白檢測。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和具體實施例來對本發明作進一步說明。
[0028]以下實施例中，0CT4(鼠源）、PGP9.5(兔源）和C-KIT(大鼠源）單克隆抗體購于 Mi 11 ipore公司；CD29 (鼠源）購于BD公司；GFRA1 (鼠源）、PLZF(鼠源）、LIN28 (兔源）和CD9〇 (鼠源）單克隆抗體購于Santa Cruz公司；NAN0G(兔源）單克隆抗體購于（cell signaling technology，CST)公司；（Alexa Fluor 568)焚光標記羊抗鼠二抗，（Alexa Fluor 568)焚光 標記羊抗兔二抗，（FITC)焚光標記羊抗鼠二抗購于Invitrogen公司；Hoechst 33342購于 Molecular Probes公司。其他原料均來源于市售。
[0029] 實施例1 一種新生仔豬睪丸生殖干細胞的高效獲取方法
[0030] 請參閱圖1和