2和95 %空氣、絕對濕度條件下進行培養，細胞長到80 % -90 %融合時繼續傳代擴增。 [0036]待MSCs傳代培養到第3代后，可以采用流式細胞儀檢測細胞表型。以進一步驗證和 鑒定該分離得到的細胞為MSCs。
[0037] 上述間充質干細胞完全培養液配方是以DMEM/F12(l:l)basiC培養基為基礎，以及 含有如下組分：
[0038] 表1
[0039]
[0040] DMEM/F12(l:l)basic 培養基的配方如下：
[0041] 表 2
[0042]
[0044] 二、間充質干細胞誘導分化成軟骨細胞
[0045] 將培養至第3代的間充質干細胞收集并離心，用間充質干細胞完全培養液重懸細 胞，接種在25cm2的培養瓶中，每隔1天換液，細胞長至鋪滿瓶底時，進行向軟骨細胞分化。細 胞分化第1天開始使用軟骨細胞誘導分化培養液，令其向軟骨細胞分化，每瓶同時加入OmM、 111^、511^、1〇11^牛磺酸，每3天換液1次，共培養16天即得分化的軟骨細胞。
[0046] 上述軟骨細胞誘導分化培養液配方是以DMEM培養液為基礎，以及含有如下組分：
[0047] 表 3
[0048]
[0049]
[0050] 上述的軟骨細胞誘導分化培養液含有干細胞定向誘導為軟骨細胞的因子。TGF-03 通過受體激活某些特定的細胞信號通路從而啟動軟骨細胞特異性基因的轉錄，從而上調Π 型膠原的合成與表達;地塞米松作為非特異的促間充質干細胞向軟骨細胞分化的因子，可 與間充質干細胞膜上的糖皮質激素受體結合，激活細胞表面受體，促進間充質干細胞向軟 骨細胞分化，并可抑制間充質干細胞向其他類型細胞分化。
[0051 ] DMEM培養基配方如下：
[0052] 表 4
[0053]
[0054] 三、分離培養和培養傳到第3代的間充質干細胞的檢測結果：
[0055] 分離培養原代(Po代)和培養傳到第3代(P3代）的間充質干細胞的放大40倍的光鏡 結果:其中，圖1中A為原代培養Po代第4天的細胞生長狀況，鏡下觀察可見，經過幾天的培養 換液后，懸浮細胞被棄去，出現特異的貼壁細胞增殖克隆；圖1中B為原代培養Po代第8天的 細胞生長狀況，細胞呈纖維狀，旋渦狀排列生長，符合間充質干細胞的特性，培養成功；圖1 中C為培養P 3代時的細胞生長狀況，細胞排列緊密，胞呈纖維狀，旋渦狀排列生長。說明成功 獲得間充質干細胞，且細胞生長狀況良好。
[0056]分離培養傳到P3代的間充質干細胞的流式檢測結果:將上述分離培養傳到P3代的 間充質干細胞采用流式細胞儀檢測傳代培養后的間充質干細胞的表型:常規的流式方法測 定間充質干細胞特異性表達標記，該流式細胞檢測所需試劑為:PE標記的⑶34、CD45、⑶73 和⑶105抗體。檢測的結果如圖2所示，其中圖2A為傳代培養MSCs的⑶34、⑶45、⑶73和⑶105 表達率柱狀圖，圖2B為MSCs的CD34表達率圖，圖2C為MSCs的CD45表達率圖，圖2D為MSCs的 ⑶73表達率圖，圖2E為MSCs的⑶105表達率圖。由該圖2可看出，間充質干細胞分離純化后， 其特異性標記物⑶73表達率為99.8%，CD105表達率為99.7%，兩者的表達量均明顯大于 95% ;其造血細胞標記的⑶34和⑶45表達率分別為1.31 %和1.81 %，兩者的表達量均低于 2.5%，兩者表達呈陰性。由此證明了分離純化的細胞為間充質干細胞。
[0057] 四、間充質干細胞誘導分化成軟骨細胞的檢測結果：
[0058] 間充質干細胞誘導分化成軟骨細胞的分化7天和14天的光鏡結果:其中，圖3A是向 軟骨分化7天，放大40倍和100倍的光鏡圖，向軟骨細胞誘導至第7天時的骨髓間充質干細胞 形態長梭形、紡錘形特征不明顯，細胞間排列漸不緊密，細胞形狀出現不規則，胞體變大，一 些生長密集區域出現復層生長細胞，不同濃度的牛磺酸組細胞生長狀況良好，與未加牛磺 酸組沒有差異；圖3B是向軟骨細胞分化14天，放大40倍和100倍的光鏡圖，向軟骨細胞誘導 至第14天時的骨髓間充質干細胞形態的長梭形、紡錘形特征進一步不明顯，細胞間排列進 一步不緊密，細胞形狀出現不規則，胞體變大，細胞核變小，一些生長密集區域出現復層生 長細胞，不同濃度的牛磺酸組細胞生長狀況良好，與未加牛磺酸組沒有差異。
[0059]間充質干細胞誘導分化成軟骨細胞的Real-Time PCR檢測結果：Π 型膠原是軟骨 細胞特異性物質之一，收集培養到P3代的間充質干細胞和加入O-lOmM牛磺酸作用的向軟骨 細胞誘導分化16天的細胞，用HP Total RNA Kit(廠商0MEGA，貨號R681L-2)提取總的RNA， 根據現有的方法反轉錄成cDNA，然后進行Real-Time PCR，檢測不同處理組人軟骨細胞特異 的Π 型膠原mRNA的表達情況。檢測結果顯示向軟骨細胞誘導分化16天的細胞比未進行分化 的P3代的間充質干細胞的二型膠原表達水平明顯增高，說明向軟骨細胞分化成功，見圖4A 所示的柱狀圖。見圖4B，比較不同濃度牛磺酸對間充質干細胞向軟骨細胞誘導分化的影響。 檢測結果顯示，與未加入牛磺酸組比較(0mM組），牛磺酸濃度為5mM組的Π 型膠原mRNA的表 達水平明顯升高，說明5mM濃度的牛磺酸提高間充質干細胞向軟骨細胞分化的能力。
[0060]牛磺酸的加入促進間充質干細胞向軟骨細胞的誘導分化，5mM的作用濃度最為明 顯。由此考慮在做間充質干細胞或是軟骨細胞移植時，可同時將局部給牛磺酸或是將牛磺 酸做成緩釋制劑，給細胞提供一個較高濃度的牛磺酸的環境，有利于增加向軟骨細胞分化 的效率，提高治療的效果。而且，牛磺酸價格低廉，常作為促進嬰兒神經系統發育的藥物，使 用安全，是一個簡單有效的方法，有利于推廣。
[0061]以上所述的實施例僅用于說明本發明的技術思想及特點，其目的在于使本領域內 的技術人員能夠理解本發明的內容并據以實施，不能僅以本實施例來限定本發明的專利范 圍，即凡本發明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發明的專利范圍內。
【主權項】
1. 一種促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 人臍帶間充質干細胞的培養:將廢棄的人臍帶組織剪碎，用質量體積比濃度0.1 % 的二型膠原酶消化成單個的細胞，離心；用間充質干細胞完全培養液重懸細胞，過篩，收集 細胞懸液，于37°c、體積分數為5%0) 2和95%空氣、絕對濕度條件下進行培養，每隔1天換培 養液，得高純度的臍帶間充質干細胞； (2) 向軟骨細胞誘導分化:將培養至第3代的臍帶間充質干細胞收集并離心，用間充質 干細胞完全培養液重懸細胞接種到底面積為25cm 2培養瓶中，細胞完全鋪滿瓶底后，培養液 更換為軟骨細胞誘導液進行向軟骨細胞的分化，細胞分化第1天開始加入O.l-lOmM牛磺酸， 共培養16天即得分化的軟骨細胞。2. 根據權利要求1所述的促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在 于，所述步驟(2)中細胞分化第1天開始加入O.l-lOmM牛磺酸，每星期換液2次，共培養16天 即得分化的軟骨細胞。3. 根據權利要求1或2所述的促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征 在于，細胞分化第1天開始加入5mM牛磺酸。
【專利摘要】本發明公開了一種促進人臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，將人臍帶組織剪碎，消化成單細胞，離心，用間充質干細胞完全培養液重懸細胞，過篩，培養得到高純度的人臍帶間充質干細胞；再將培養至第3代的間充質干細胞收集并離心，用間充質干細胞完全培養液重懸細胞接種到底面積為25cm2培養瓶中,細胞完全鋪滿瓶底后，培養液更換為軟骨細胞誘導液進行向軟骨細胞的分化，細胞分化第1天開始每瓶同時加入不同濃度的牛磺酸，共培養16天即得分化的軟骨細胞。本發明添加的牛磺酸是人體所需的，使用安全；能夠提高間充質干細胞向軟骨細胞分化的能力。
【IPC分類】C12N5/077
【公開號】CN105647856
【申請號】
【發明人】李洲, 么秀華, 黃慧玲, 孫雪蓮, 朱建民, 魏華英, 李召雨, 劉江, 周洪銳, 劉曉華, 李昀地, 楊延瑞, 范維佳
【申請人】關節動力安達（天津）生物科技有限公司, 天津中新科炬生物制藥有限公司, 天津市神經外科研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日