養液。其中增殖培養基的成分為80 % DMEM/F12+10 %胎牛血清+10 %馬血清。
[0023](6)待細胞長至80 %?90 %匯合度時，吸去培養瓶中舊培養液，用預熱的37 °C的DPBS清洗細胞，以去除殘余的血清和組織塊及死細胞，重復2次，向培養瓶中加入0.25 %的胰酶-EDTA Iml，然后將培養瓶置于37°C恒溫培養箱中預熱3min，取出培養瓶放于顯微鏡下觀察細胞的消化情況，待細胞變圓，脫落，立即加入兩倍體積的增殖培養液終止消化，用吸管吸取培養基反復吹打瓶壁的細胞，使之從瓶壁上脫落形成細胞懸液，按1:2的比例進行細胞的傳代，放回細胞培養箱繼續培養。
[0024]2、山羊骨骼肌衛星細胞的純化
[0025]原代山羊骨骼肌衛星細胞的純化采用差速貼壁法，首先在細胞培養3天后，用DPBS洗滌3次，每次10?20s，胰酶消化3?4min，加入2倍體積增殖培養液終止消化；1500轉離心7min，收集細胞，加入增殖培養液重懸，按5 X 14個接種至事先包被有明膠的培養皿上培養I小時，我們通過摸索成纖維細胞的最短貼壁時間，確定了 Ih的最佳時間。當有大量細胞貼壁時取上層未貼壁的懸浮細胞重新接種至新的培養皿上，此時貼壁的細胞主要為成纖維細胞，由于骨骼肌衛星細胞細胞的鐵壁速度較慢，此步驟可以重復2-3次，第4天換液，去除血細胞及未貼壁的死細胞，并觀察細胞生長情況，此后連續5天進行細胞的純化。
[0026]3、山羊骨骼肌衛星細胞的傳代
[0027]細胞生長至80%?90 %匯合時傳代，棄去培養皿中的培養基，加入預熱的I3BS洗滌I?2次后加入500μ1 0.25%的胰酶-EDTA進行消化，顯微鏡下觀察，當絕大多數的細胞脫落后立即加入Iml的培養基終止消化，按1:3接種于新的培養基，3d傳代一次，此后連續5代均采用差速貼壁法收集20min未貼壁的細胞，以去除成纖維細胞。
[0028]4、山羊骨骼肌衛星細胞的凍存
[0029]待純化后的山羊骨骼肌衛星細胞長至90%的匯合度時，進行山羊骨骼肌衛星細胞的凍存。首先需要配制細胞凍存液，40 % FBS+10% DMS0+50 %培養液，首先加入預熱的DPBSlml清洗細胞，再加入0.25 %的胰酶-EDTA消化3?5min，至大部分細胞變圓時終止消化，1200r/min離心3min，小心吸取上清液，然后用凍存液重懸，將重懸的細胞按每個凍存管500μ1的量進行凍存。將凍存管先放入-80°C冰箱4h，然后再轉移至液氮罐中進行保存。
[0030]5、山羊骨骼肌衛星細胞的鑒定
[0031]山羊骨骼肌衛星細胞的鑒定運用三種方法進行，包括RT-PCR、免疫熒光染色法、以及進行成肌誘導。進行RT-PCR時首先設計骨骼肌衛星細胞特有的Pax7、Desmin、MyoD基因的擴增引物，提取純化的骨骼肌衛星細胞的總RNA，然后反轉錄成cDNA，最后通過普通PCR進行擴增；利用免疫熒光染色法:利用Pax7和Desmin的一抗進行；成肌誘導體系是2 %馬血清+DMEM/F12進行成肌誘導，誘導7天之后利用免疫熒光染色的方法，MyoG和MyHC—抗進行染色鑒定肌細胞。結果表明本發明能夠得到純度較高的山羊骨骼肌衛星細胞系。
[0032]以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
【主權項】
1.山羊骨骼肌衛星細胞的分離純化方法，包括以下步驟: (1)采集山羊肌肉組織，先用酒精清洗消毒，再用生理鹽水沖洗后放入DMEM/F12培養基中，于12h之內進行骨骼肌衛星細胞的分離； (2)用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗肌肉組織，將其剪成0.5X0.5cm的大組織塊； (3)將獲得的大組織塊放入培養皿中，加入0.25 %胰蛋白酶-EDTA進行消化，保證胰蛋白酶能夠完全沒過大組織塊，4°C條件下靜置12h，加入增殖培養基終止消化;之后將培養皿中的大組織塊連同培養液轉移至50ml的離心管內，1000r/min離心8min，吸除上清液，再用增殖培養液重懸，用無菌吸管將大組織塊及培養液轉移至培養皿中； (4)將步驟(3)得到的大組織塊再剪成0.5?Imm3的小組織塊，再加入適量的增殖培養液，將小組織塊均勻地鋪開在培養皿中，各小組織塊之間的間距在3mm，吸去培養基，待小組織塊充分吸附于培養瓶后，再把培養瓶翻轉過來觀察小組織塊是否充分吸附于培養瓶上，再慢慢加入預熱至37 V的培養液，重新置于細胞培養箱中進行原代培養，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況，每兩天更換培養液;待細胞長至80 %?90 %匯合度時，吸去培養瓶中舊培養液，用預熱至37°C的PBS清洗細胞，以去除殘余的血清和組織塊及死細胞，重復2次，從而得到未純化的山羊骨骼肌衛星細胞； (5)采用差速貼壁法進行原代山羊骨骼肌衛星細胞的純化:首先將步驟(4)得到的未純化貼壁細胞用DPBS洗滌3次，胰酶消化3min，加入2倍體積增殖培養液終止消化；1500r/min離心7min，收集細胞，加入增殖培養液重懸;按5 X 14?8 X 14個接種至事先包被有明膠的培養皿上培養Ih，當有大量細胞貼壁時取上層未貼壁的懸浮細胞重新接種至新的培養皿上，此時貼壁的細胞主要為成纖維細胞，由于骨骼肌衛星細胞的貼壁速度較慢，此步驟重復2?3次，第4天換液，去除血細胞及未貼壁的死細胞，并觀察細胞生長情況，此后連續5天進行骨骼肌衛星細胞的純化。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述青霉素的濃度為500IU/ml，所述鏈霉素的濃度為500yg/ml。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述增殖培養基的成分為80% DMEM/F12+10%胎牛血清+10%馬血清。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，加入3ml的0.25 %胰蛋白酶-Η)ΤΑ進行消化。
【專利摘要】本發明公開了山羊骨骼肌衛星細胞的分離純化方法，包括山羊骨骼肌衛星細胞的分離和山羊骨骼肌衛星細胞的純化兩大步驟。本發明采用胰蛋白酶消化和組織塊法相結合進行骨骼肌衛星細胞的分離，在細胞傳代時繼續進行差速貼壁法進行山羊骨骼肌衛星細胞的純化，并通過后期傳代過程中連續5代以上繼續采用差速貼壁法進行山羊骨骼肌衛星細胞的純化，得到了純度更高的骨骼肌衛星細胞。
【IPC分類】C12N5/077
【公開號】CN105647857
【申請號】
【發明人】凌英會, 王康巖, 朱龍, 章孝榮, 張運海, 李運生, 吳昊, 睢夢華, 鄭琪
【申請人】安徽農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月8日