當歸多糖在骨髓間質干細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及當歸多糖在骨髓間質干細胞中的應用，尤其涉及當歸多糖在炎性因子 微環境中對骨髓間質干細胞增殖的影響和遺傳穩定性的保護作用。
【背景技術】
[0002] 骨髓間充質干細胞(BMSCs)是典型的成體干細胞之一，來源于骨髓，具有高度自我 更新、較強增殖能力與多向分化能力，在體外特定條件下可誘導分化為軟骨細胞、骨細胞、 心肌細胞、干細胞、脂肪細胞等，被認為是組織器官損傷修復的重要細胞來源。此外BMSCs具 有免疫原性低、腫瘤趨向性及易于導入各種基因的優良特性。BMSCs作為靶向抗癌載體運用 于腫瘤生物治療研究引起越來越多的關注。經過基因修飾的BMSCs到達腫瘤所在部位后表 達治療相關分子或自殺基因，從而達到緩解或治愈腫瘤的目的。MSCs作為載體攜帶IFN-β、 TRAIL等抗癌分子治療腫瘤獲得了明顯療效，開啟了腫瘤新型的治療途徑。
[0003] 近期研究表明，干細胞的命運受其所處的微環境的影響。正常機體微環境中，干細 胞的增殖和凋亡處于平衡狀態以保證干細胞功能的正常，一旦這種平衡被破壞后，干細胞 將會分化為腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)或發生惡性 轉化。Weber CE等研究發現骨橋蛋白（Osteopontin, 0ΡΝ)能夠使乳腺癌微環境中的MSCs轉 化為TAFs，此過程依賴于TGF-βΙ的介導。!1〇11 [等發現在C6膠質瘤微環境中MSCs可表現出惡 性腫瘤細胞的特征，增殖能力明顯增強，GP130，STAT-3，CyclinDl和BCL-xl的表達明顯增 加，并且IL-6和IL-6R水平明顯升高；SIL-R/GP130的活化可能是腫瘤微環境中MSCs出現惡 性轉化的重要原因之一。通過STA-21阻斷STAT3信號通路可以降低腫瘤微環境中MSCs腫瘤 樣轉化的風險。IFN-γ和TNF-α通過NFKB/SMAD7信號通路協同誘導MSCs損傷和通過NFkB調 節的癌基因激活導致腫瘤的發生。
[0004] 干細胞發生惡性轉化與其微環境中的炎癥密切相關。炎癥已被認為是腫瘤的一大 特征。在生物體損傷或病原體入侵后，炎癥需要一系列復雜的防御機制協調來恢復自我平 衡。炎癥是一把雙刃劍。機體在正常生理情況下，能對外來或者內在刺激作出炎癥反應，具 有消除損傷因子、修復組織損傷等重要防御作用，通常此反應對機體是有利的;但在一些情 況下，如長期的慢性炎癥存在時，炎癥對機體的反應又是潛在有害的。Luo等研究發現亞硝 酸鹽誘導的炎癥可促進細胞惡性轉化和EMT，其中的分子機制是由于炎性因子IL-6的分泌 進一步活化STAT3和miR-21的表達;通過抗IL-6抗體培養人支氣管上皮細胞，亞硝酸鹽誘導 細胞惡性轉化和EMT可被逆轉。已有研究報道，多種腫瘤的形成與其長期的炎癥存在密切相 關。各種化學、生物因素等誘導腫瘤形成的過程中，炎性因子起著十分重要的作用，如IL-6、 TGF-βΙ〇
[0005] IL-6是存在于腫瘤微環境中的細胞因子，通過活化STAT3，MAPK和AKt信號通路促 進腫瘤細胞的增殖，血管形成，侵襲和轉移；IL-6可通過改變N-cadherin，vimentin， snail, twist 和 E-cadherin的表達來促進上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT)，進一步導致腫瘤的轉移；IL-6可促進干細胞微球體形成和自我更新， 有助于腫瘤細胞干性的維持，具有招募MSCs的作用；IL-6通過gpl30/MAPK/STAT3調節的轉 錄因子C/ΕΒΡβ/δ的活化、p-glycoprotein的過度表達、EMT轉化和干細胞的擴增促進腫瘤細 胞的多重耐藥。IL-6已經被認為是一種促瘤因子，參與多種腫瘤的發生、發展，與神經膠質 瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌等中路密切相關。IL-6可通過與gpl30結合形成復合體，進一 步與其下游的JAK激酶結合，發揮生物效應，進而與轉錄激活子-3(STAT3)調控靶基因。 Jak/STAT3信號通路被認為是聯系炎癥與腫瘤的橋梁。已有研究表明，肺癌患者血清IL-6水 平與臨床分期及治療效果有一定的關聯性，臨床分期與血清IL-6含量呈正相關;治療效果 與血清IL-6含量負相關。此外IL-6在乳腺癌中還能誘導EMT發生，同時也與腫瘤干細胞 (CSC)活性關系密切，而EMT與CSC進一步又影響著EGFR-TKI藥物的耐藥發生。最近的研究報 道揭示，IL-6/STAT3信號通路與NF-κΒ通路起到協同作用，進一步誘導某些細胞因子的表 達，從而以正反饋調節方式促進腫瘤干細胞的形成。研究發現BMSCs與C6腦膠質瘤細胞間 接共培養后BMSCs發生了瘤化，重要機制之一為C6腦膠質瘤細胞高分泌白介素6，從而激活 下游相關信號通路，包括IL-6/JAK/STAT3信號通路，從而導致BMSCs發生惡性轉化，證實了 C6腦膠質瘤細胞微環境中某些分泌性因子可以誘導BMSCs發生惡變。Iliopoulos等研究發 現，IL-6能夠誘導非腫瘤干細胞向腫瘤干細胞的轉變。最近，Marotta等利用shRNA文庫篩 選發現，IL-6 /STAT3信號通路是乳腺癌干細胞的增殖所必需的。
[0006] 正常情況下，TGF-β與T淋巴細胞之間相互作用，使機體處于平衡狀態。病理情況 下，TGF-m過度表達，過高水平的TGF-m打破了這種平衡導致轉化生長因子對淋巴細胞抑 制作用增強，導致機體的免疫監督功能受到破壞，使機體對病原體、腫瘤細胞的免疫監視、 免疫反應能力遭到削弱或喪失，導致疾病或腫瘤的發生。Chen等測定了 TGF-m在原發性肝 癌患者癌組織與癌旁組織中的表達水平，結果顯示肝癌組織TGF-m表達陽性率明顯高于 癌旁組織，結果有統計學意義。在腫瘤微環境中，TGF-m言號通路在BMSCs向癌癥相關成纖維 細胞分化過程中起非常重要作用，將誘餌TGF-β受體基因骨形態發生蛋白和激活素結合抑 制劑導入BMSCs中，成功阻斷了TGF-i3/Smad信號通路的活化和CAF相關標志物的表達，并且 成功抑制了 BMSCS對乳腺癌生長的促進作用。
[0007] 炎性因子作為炎癥微環境的重要成員之一，也參與了腫瘤的起始與演進。研究者 將膠質瘤微環境中同等水平濃度的外來IL-6誘導大鼠 BMSCs，結果發現，經過2個月長時間 誘導后BMSCs生長接觸抑制減弱，蛋白結果表明p53蛋白表達明顯降低，MDM2蛋白明顯升高， 接種裸鼠皮下可形成腫瘤。文獻報道，通過IL-4和GM-CSF培養人MSCs，發現MSCs出現與腫瘤 細胞相似的形態和表型，將其注入免疫缺陷鼠體內，能引起肺結節的快速增長。炎癥反應微 環境不僅通過調控干細胞的自我更新和分化潛能，還能夠增加細胞突變的概率，并且能夠 增加突變細胞的增殖能力。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了當歸多糖在骨髓間質干細胞中的應用，具體來說是提供當歸多糖在 炎性因子微環境中對骨髓間質干細胞增殖的影響和遺傳穩定性的保護作用。
[0009] 本發明提供當歸多糖在骨髓間質干細胞中的應用。
[0010] 作為優選，所述應用為當歸多糖對炎性因子微環境下的骨髓間充質干細胞的增殖 和遺傳穩定性的保護作用。
[0011] 作為優選，所述炎性因子為IL-6和/或TGF-m。
[0012] 作為優選，所述應用為當歸多糖抑制炎性因子微環境下的骨髓間充質干細胞的遺 傳穩定性變化。
[0013] 作為優選，所述應用為當歸多糖抑制炎性因子微環境下的骨髓間充質干細胞的增 殖。
[0014] 作為優選，所述當歸多糖的濃度為50μg/ml。
[0015] 本發明還提供當歸多糖在制備炎性因子微環境下骨髓間質干細胞抑制劑中的應 用。該抑制劑以當歸多糖作為有效成分。當歸多糖的濃度優選為SOμg/ml。
[0016] 作為優選，所述當歸多糖的制備方法為:將當歸先醇提，然后水提得到水提液;將 水提液去除蛋白后，醇沉得到當歸多糖。
[0017] 作為優選，所述醇提是用90-95%乙醇提取兩次，每次0.5-1.5h，加液重量分別為6 倍和4倍。
[0018] 作為優選，所述水提是用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水重量分別為8、6、6 倍。
[0019] 作為優選，所述醇沉是在去除蛋白質的水提液中加入95%乙醇至醇體積濃度為75-80%，低溫靜置22-26h后，再次用相同的方法進行沉淀。
[0020] 作為優選，在醇沉后還包括減壓干燥的步驟。
[0021] 本發明利用IL-6和TGF-m建立腫瘤相關炎性微環境，觀察IL-6、TGF-m單獨或聯 合對BMSCs的形態、微絲、增殖及增殖基因 Bcl-2、癌基因 Ras蛋白表達的變化;分析并探討當 歸主要有效成分-當歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide, ASP)等對腫瘤相關炎 性微環境中BMSCs增殖的影響及遺傳穩定性保護作用。
[0022] 腫瘤相關炎性微環境