一種雞新城疫弱毒株及其在制備雞新城疫油乳劑滅活疫苗的應用
【專利說明】一種雞新城疫弱毒株及其在制備雞新城疫油乳劑滅活疫苗的 應用
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技術領域： 本發明涉及雞新城疫的病原以及預防，特別是一種雞新城疫弱毒株及其在制備雞新城 疫油乳劑滅活疫苗的應用。
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【背景技術】： 新城疫(Newcastle Disease，ND)，又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟等，是發生于雞、鴿、鵪鶉、火 雞等家禽和野生禽類的一種急性、敗血性和高度接觸性傳染病，是世界動物衛生組織(0ΙΕ) 規定的法定必報傳染病之一。其病原是新城疫病毒(Newcastle Disease Virus JDVhNDV 屬于副黏病毒科，副黏病毒亞科，聰腺炎病毒屬(RubulavirusXNDV只有1個血清型，但通過 遺傳發生分析，可將不同地區的流行毒株或疫苗株分成若干個基因型或抗原群。近年來，我 國流行的主要毒株屬于NDV W、Vni、IX基因型，其中基因 W型是主要流行毒株。基因 W型包 括Wa、Wb、Wc、Wd、We 5個亞型，我國流行的主要是Wd、We亞型。新城疫不僅給家禽養 殖業帶來嚴重的經濟損失，而且還嚴重影響禽和禽類相關產品的國際貿易。因此，世界各國 對該病的發生流行均采取非常嚴格的防控措施。1990年代以來，我國新城疫在疫苗免疫雞 群中的發生逐漸嚴重，主要特征是產蛋量大幅下降以及死亡率低、抗體滴度高，這種非典型 新城疫嚴重危害了雞的生產性能，給養禽業造成了巨大損失。
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【發明內容】
： 本發明的目的是提供一種低致病力的雞新城疫病毒，該病毒具有免疫原性好，安全的 特性。
[0004] 本發明的技術方案是，一種雞新城疫弱毒株，藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，微生物保藏編號為CGMCC No. 11290。
[0005] 保藏地址為:北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0006] 保藏日期:2015年10月19日。
[0007] 分類命名:雞新城疫病毒。
[0008] -種雞新城疫弱毒株在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應用。
[0009] -種雞新城疫弱毒株由其制備雞新城疫油乳劑滅活疫苗的制備，步驟包括： (1) 以權力1要求所述的弱毒株為種毒，PBS緩沖液等量稀釋后接種雞胚尿囊腔，每胚 0.1-0.2mL，37 °C孵育，孵育96h后收獲尿囊液，計量加入0.1%的甲醛溶液滅活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸鋁，攪拌至透明，高壓滅菌即 得油相； (3) 抗原液和滅菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振搖，使Tween-80完全溶解，即 為水相； (4) 油相和水相按照2份:1份混合乳化，即油相2份注入膠體磨中，打開開關攪動油相， 同時緩慢加入水相1份，攪拌轉速由慢到快充分乳化，即完成制備。
[0010] 本發明分離得到的毒株是一株免疫原性好、生產性能優良、適宜大規模生產的種 毒。由該毒株制備的活疫苗產品質量合格，具備產業化生產的條件。
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【具體實施方式】： 實施例1， (1) 以微生物保藏編號為CGMCC No. 11290的弱毒株為種毒，PBS緩沖液等量稀釋后接種 雞胚尿囊腔，每胚0.1-0.2mL，37 °C孵育，孵育96h后收獲尿囊液，孵育96h后收獲尿囊液，計 量加入0.1%的甲醛溶液滅活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸鋁，攪拌至透明，高壓滅菌即 得油相； (3) 抗原液和滅菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振搖，使Tween-80完全溶解，即 為水相； (4) 油相和水相按照2份:1份混合乳化，即油相2份注入膠體磨中，打開開關攪動油相， 同時緩慢加入水相1份，攪拌轉速由慢到快充分乳化，即完成制備。
[0012] 具體實例:病料采集及處理 病料來自河南省衛輝市某蛋雞場，選擇自然發病死亡6h內或頻死雞，無菌采集氣管組 織塊、肝臟、腎臟、腦，加10倍生理鹽水，在研缽內反復研磨成乳劑，4000r/min離心10min，反 復2次。取上清液向其中按1 %的量加入雙抗，于4 °C冰箱內過夜保存。
[0013] 2雞胚接種及尿囊液的收集 無菌條件下，將上清液接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量為0.2mL/胚。將接種的雞 胚置37°C恒溫箱孵育。每4h照蛋一次，將死亡雞胚或垂死雞胚取出置4°C冰箱保存，7d后將 所有雞胚取出置于4°C冷卻，收集尿囊液。重復傳3代，收尿囊液4000r/min離心15min，收上 清液冷凍保存。
[0014] 3血凝特性測定 分別采集豬、兔、犬、綿羊、豚鼠、小鼠、山羊、雞、人的〇型紅細胞。將紅細胞用生理鹽水 制成1%的懸液。在V型血凝板上，每孔滴加 ros液(PH7.0)0.025mL，每孔分別滴加待檢病毒 0.025mL，混勻后棄去0.025mL，之后每孔滴加1%( v/v)紅細胞懸液0.025mL，每種動物紅細胞 2個重復，置于微型混合器上振蕩lmin，置于室溫條件下（18 °C_20 °C )35min后，觀察可見紅 細胞均出現凝集(見表1)。
[0015] 表1分離毒株對不同種紅細胞血凝(HA)圖譜
在V型血凝板上，5排每孔滴加 PBS液(PH7.0 )0.025mL，每孔分別滴加待檢病毒0.025mL， 混勻后棄去〇.〇25mL，第1排每孔滴加抗NDV標準陽性血清0.025mL，第2排每孔滴加抗AIV H9 亞型標準陽性血清0. 〇25mL，第3排每孔滴加抗AIV H5亞型標準陽性血清0.025mL，第4排每 孔滴加抗EDS標準陽性血清0.025mL，第5排滴加鹽水0.025mL為對照，充分混勻后室溫下孵 育20min。之后滴加1%(v/v)紅細胞懸液0.025mL，每種紅細胞1列孔，充分混勻后室溫下作用 35min，觀察可見，第1、5排紅細胞無凝集，第2、3、4排紅細胞凝集(見表2)。
[0016] 表2分離毒株對不同紅細胞血凝性抑制試驗
4雞胚平均致死時間(MDT)測定 將新鮮的感染尿囊液用滅菌生理鹽水連續10倍遞增稀釋成1〇_7-1〇_9。每個稀釋度經 尿囊腔上午8點接種5枚10日齡SPF雞胚，O.lmL/胚，置于37°C培養。同日16點，每個稀釋度另 接種5枚雞胚，0