T淋巴細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種單克隆抗體及其應用，特別涉及一種抗鵝CD4胞外區單克隆抗體 及其在檢測禽類外周血中CD4+T淋巴細胞中的應用，本發明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] T淋巴細胞(簡稱T細胞)是重要的免疫活性細胞，具有直接介導細胞免疫應答和對 機體免疫應答起調節性的關鍵作用。在T細胞的不同發育階段，細胞表面表達不同種類的受 體和表面抗原。T細胞根據功能的不同可分為不同的亞群，包括細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell,TC)，輔助性T細胞(helper T cell,ΤΗ)及抑制性T細胞（suppressor T cell,TS) 等。CD4表達于輔助性T細胞的表面。細胞免疫中，T細胞對于抗原的識別需要依賴T細胞抗原 受體（T cell receptor,TCR)和主要組織相容性復合體（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子的相互作用，成熟的T細胞表達CD4分子，其作為標記的表面蛋白參與抗 原的識別過程。
[0003] CD4是一個單鏈的跨膜糖蛋白，表達在免疫細胞表面，例如輔助性Τ細胞，胸腺細 胞，巨噬細胞，單核細胞和樹突狀細胞。CD4蛋白包含4個Ig樣區(D1-D4)，一個跨膜區和一個 與酪氨酸激酶p561ck相關的胞質尾區，而這個區域與T細胞的活化相關，CD4與MHCII類分子 相互作用是由于D1區域中保守的氨基酸與MHC Π 類分子非多形態的部分結合。
[0004] 禽類⑶4分子的研究遠遠落后于哺乳類。1999年Koskinen首次克隆了雞⑶4分子的 cDNA，包含1990個核苷酸，其編碼的開放閱讀框包括402個氨基酸構成的含有4個Ig樣區的 胞外區，24個氨基酸構成的疏水性的跨膜區以及33個氨基酸構成的胞質尾區，這整個cDNA 和人及鼠的序列同源性僅為24%，但在功能方面具有重要作用的氨基酸殘基卻具有高度保 守性。因此，雞和哺乳動物的CD4分子在生物化學和功能上的相似性很明顯。與猩猩和人的 CD4分子相比，雞的CD4分子由于存在較多的糖基化位點而導致更顯著的糖基化。鴨細胞的 免疫研究是從Wilkinson等用抗人的CD3抗體對鴨T細胞進行鑒定后才開始的。2005年 Kothlow等克隆獲得了鴨⑶4基因，鴨⑶4分子的開放閱讀框為1446bp，編碼481個氨基酸，與 雞⑶4分子的相似性為60.2%，與人⑶4分子的相似性為19.2%，且對鴨的⑶4進行真核表達 并制備出了單克隆抗體，而且還對鴨脾臟，胸腺，法氏囊及外周血液中的淋巴細胞類型進行 了鑒定，對其功能也做了研究。2013年X.Yan等從四川白鵝胸腺中克隆得到鵝的CD基因，基 因全長1940bp，含有一個1443bp的完整開放閱讀框，共編碼480個氨基酸。并對鵝的⑶4組織 表達譜進行了研究，以及利用免疫組化通過鼠抗鴨CD4單克隆抗體分析不同日齡鵝免疫組 織中的表達及分布。2013年本實驗室魏雙施等克隆了東北白鵝CD4基因并制備了抗鵝CD4胞 外區的多克隆抗體。
[0005] 單克隆抗體的研制為基礎和臨床免疫學研究創造了有利條件。針對CD分子單克隆 抗體可對動物的淋巴細胞進行分選，以研究特定表位、多肽或抗原分子的免疫應答類型及 相應細胞的功能。研究⑶3+、⑶4+、⑶8+T淋巴細胞的含量在臨床診斷上有著重要的意義，可 以了解機體細胞免疫狀態，免疫機制等。目前鵝CD4單克隆抗體制備的研究尚屬空白，這限 制了對于鵝CD4分子功能的進一步探索及鵝免疫機理的研究。
[0006] 本項發明首次利用原核表達系統表達鵝CD4胞外區基因片段，以重組蛋白為免疫 原制備鵝CD4胞外區單克隆抗體，初步建立了可檢測鵝CD4+T淋巴細胞的流式細胞術和激光 共聚焦方法，為揭示鵝T淋巴細胞發生、發育的規律、T細胞的信號轉導、T細胞亞群的分類、T 細胞的組織分布、動態變化等研究及其在機體免疫防御中的作用，提供理論依據及物質基 礎。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題之一是提供一種能夠穩定分泌抗鵝CD4胞外區單克隆 抗體的雜交瘤細胞株以及由該雜交瘤細胞株分泌所產生的單克隆抗體。
[0008] 本發明所要解決的技術問題之二是提供所述單克隆抗體在制備檢測禽類外周血 中⑶4+T淋巴細胞試劑中的應用。
[0009] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的：
[0010] 本發明利用本實驗室構建好的攜帶鵝⑶4胞外區的重組原核表達載體pET-30a-CD4ex，采用大腸桿菌Rosetta?(DE3)pLysS表達鵝CD4胞外區基因，得到重組蛋白rGopET-30a-CD4ex。以重組蛋白rGopET-30a-CD4ex為免疫原，正常免疫三次BALB/c小鼠，再加強免 疫一次，取BALB/c小鼠脾淋巴細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選獲得1株穩定分泌抗鵝 CD4胞外區單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為5A9,分類命名為抗鵝CD4胞外區單克隆抗體 雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京 市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號是:CGMCC N0.11192,保藏時 間是:2015年9月14日。
[0011] 進一步，本發明還提出了由保藏號為CGMCC N0.11192的雜交瘤細胞株分泌產生的 抗鵝CD4胞外區單克隆抗體。經抗體亞類試劑盒鑒定，雜交瘤細胞株5A9所產生的單克隆抗 體為IgG2a型。間接ELISA結果顯示，所述單克隆抗體能與純化的重組鵝CD4胞外區蛋白 rGopET-30a-CD4ex反應，同時也能夠與分離的鸛外周血淋巴細胞發生反應。激光共聚焦及 流式細胞術結果顯示該抗鵝CD4胞外區單克隆抗體也可以與雞、鴨外周血淋巴細胞發生反 應。
[0012] 因此，更進一步的，本發明還提出了所述的抗i|CD4胞外區單克隆抗體在制備檢測 禽類外周血中CD4+T淋巴細胞試劑中的應用。其中，優選的，所述禽類包括鵝、鴨以及雞。
【附圖說明】
[0013]圖1為重組蛋白鵝CD4胞外區基因的SDS-PAGE鑒定；
[0014] M.蛋白質分子質量標準；1-5.誘導后的pET-30a空載體，rGopET-30a-CD4ex菌體誘 導前、誘導后、超聲上清、超聲沉淀；
[0015]圖 2 為純化的重組蛋白 rGopET-30a-CD4ex 的 SDS-PAGE;
[0016] M.蛋白質分子質量標準；1.純化的rGopET-30a-CD4ex重組蛋白；
[0017] 圖3為重組蛋白與兔抗鵝CD4胞外區多克隆抗體反應的抗原性鑒定；
[0018] Μ ·蛋白質分子質量標準；1 ·重組蛋白rGopET-30a-CD4ex; 2 ·誘導后pET-30a空載 體；
[0019]圖4為細胞株染色體計數；
[0020] A.5A9雜交瘤細胞株;B.SP2/0細胞株；
[0021 ]圖5為5A9雜交瘤細胞株分泌抗體穩定性分析；
[0022]圖6為5A9雜交瘤細胞株單抗腹水效價的測定；
[0023]圖7為5A9單克隆抗體反應性的I-ELISA鑒定；
[0024] 圖8為5A9單克隆抗體對鸛⑶4胞外區蛋白的Western blot鑒定；
[0025] Μ ·蛋白質分子質量標準；1 ·重組蛋白rGopET-30a-CD4ex; 2 ·誘導后pET-30a載體；
[0026] 圖9為5A9單克隆抗體對鸛外周血T淋巴細胞的Western blot鑒定；
[0027] M.蛋白質分子質量標準；1.鸛外周血T淋巴細胞；
[0028]圖10為5A9單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(200X)結果；
[0029] A.質粒pcDNA3.1-⑶4ex轉染的雞胚成纖維細胞與純化的5A9單克隆抗體的間接免 疫熒光分析;B.空載體pcDNA3.1 ( + )質粒對照；
[0030]圖11為5A9單克隆抗體相對親和常數的測定；
[0031 ]圖12激光共聚焦鑒定5A9單克隆抗體的交叉反應性；
[0032] A.PBL DAPI染色；B.PBL FITC染色；C.A和B合并圖像；
[0033] 圖13流式細胞術分析5A9單克隆抗體的交叉反應性；
[0034] A. 5A9與淋巴細胞反應的流式分析;B.淋巴細胞流式分析的陰性對照。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0036]本發明實施例中所涉及的材料與試劑：
[0037] 1試驗材料
[0038] 1.1試驗動物
[0039] BALB/C小鼠，SPF級6周齡，購自長春億斯實驗動物技術有限責任中心；成年白鵝購 自哈爾濱松北區華宇養殖廠;成年鴨購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;成年雞購自 某養殖廠。
[0040] 1.2細胞、菌株及質粒