. lmL/胚，置于37 °C培養。
[0017] 每天照蛋2次，連續觀察7d，記錄各雞胚的死亡時間，計算出MDT值大于130小時。 [0018] 5腦內致病指數(ICPI)測定 取HA大于24的新鮮感染尿囊液沒用無菌鹽水10倍稀釋，腦內接種1日齡SPF雛雞10只， 0.05mL/只。每24小時觀察一次，連續觀察8d。每天觀察時正常雞記0分，病雞記1分，死亡雞 記2分。計算結果ICPI為0.3875 · 6至此判定分離毒株為NDV弱毒株。將病毒盲傳19代后，基本生物活性無變化，命名為 XX09. 表3部分代次病毒紅細胞凝集價(HA)的測定
表4部分代次病毒含量測定(單位:EID50/0. lmL) 7油乳刑火沽投百的妍制及應用
7.1抗原制備。以F19代毒按1:1000稀釋，0.2mL/胚接種于9-10日齡雞胚尿囊腔，37°C 孵育，每天照蛋2次，棄24h內死胚，24h后死胚及時取出放置于4°C保存，孵育96h后取出所有 雞胚4°C放置36h，收獲尿囊液。HA價1:128以上的毒液，計量加入0.1%的甲醛溶液，37 °C滅 活24h，取樣作滅活檢驗。
[0019] 7.2油相制備。白油和Span-80按94:6，混合后，加總重量2%的硬脂酸鋁，攪拌至透 明，121°C高壓滅菌30min，即為油相。
[0020] 7 · 3水相制備。抗原液和滅菌后的Tween-80按96:4混合，充分振搖，使Tween-80完 全溶解，即為水相。
[0021 ] 7.4乳化。油相和水相按照2:1混合乳化。即油相2份注入膠體磨中，打開開關攪動 油相，同時緩慢加入水相1份，攪拌轉速由慢到快充分乳化，即成油乳劑滅活疫苗。
[0022] 7.5疫苗物理性狀檢驗 7.5.1外觀檢查。肉眼觀察為乳白色乳劑。
[0023] 7.5.2穩定性檢驗。分別取試制疫苗樣品10mL裝于離心管中，以3000r/min離心 15min，疫苗不分層。37°C保存1個月不破乳。
[0024] 7.5.3粘度檢驗。出口徑1.2mm的lmL吸管吸取疫苗樣品lmL，讓其垂直自然流出， 流出0.4mL所需的時間均在2-6s。
[0025] 7.5.4無菌檢驗。按中華人民共和國獸藥典（生物制品卷）要求進行：取滅活苗樣 品，接種硫乙醇酸鹽流體培養基(τ.G)小管及酪胨瓊脂(G.A)斜面各2支，0.2mL/支，1支置37 °C培養，1支置25 °C培養，觀察3-5d。另取0.2mL接種一支葡萄糖蛋白胨肉湯(G. P)小管，25 °C 觀察3-5d。均無細菌、霉菌生長。另外接種改良Frey氏液體及固體培養基觀察30d，無支原體 生長。
[0026] 7.5.5疫苗安全檢驗。取滅活疫苗每批樣品，每批疫苗頸部皮下注射14日齡SPF雞 各10只，2.OmL/只。飼養兩周，無發病與死亡，注射部位未見明顯的病理變化，免疫雞無異常 表現。
[0027] 7.5.6疫苗效力試驗。將制備的滅活疫苗，接種非免疫雞60只，分別在免疫前7d，免 疫后7d、14d、21d、28d采血，進行抗體效價測定。用分離的新城疫XX09株和強毒F48E9株，對 免疫后30d的雞攻毒，每只雞攻毒劑量105·*3個ELD5Q，每組30只，觀察10d，另用非免疫雞10只 攻毒作對照。
[0028] 7.5.7疫苗效力試驗結果表明，接種疫苗21d后抗體效價開始上升，60d后平均抗 體效價達29·6。疫苗注射三周后，人工感染實驗組不引起發病，而對照組攻毒3d后陸續發病， 病雞精神沉郁，腹瀉，排水樣糞便，強毒組發病率達100%，xx〇9組發病率約47%。
[0029] 8重復7.1-7.5的方法，共制油乳劑滅活疫苗7批。
[0030] 9用LaSota株為抗原，以7.1-7.5的方法，制油乳劑滅活疫苗。與XX09株疫苗做保護 對比試驗。可見兩種疫苗保護率均達100%。 「nmi1 1 η豐「欠 ?Κ?選播害癥害今獸、Mil由會圭里rpTr^/r? w、
11表6各批次滅活疫苗免疫60d后血清的血凝抑制價
上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領 域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這 里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉，而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處 于本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種雞新城疫弱毒株，藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生 物保藏編號為CGMCC No. 11290。2. 如權利要求1所述的一種雞新城疫弱毒株在制備雞新城疫弱毒活疫苗中的應用。3. 如權利要求1所述一種雞新城疫弱毒株，由其制備雞新城疫油乳劑滅活疫苗的制備， 其特征在于:步驟包括： (1) 以權利要求1所述的弱毒株為種毒，稀釋后接種雞胚尿囊腔，孵育96h后收獲尿囊 液，計量加入甲醛溶液滅活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸鋁，攪拌至透明，高壓滅菌即 得油相； (3 )抗原液和滅菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振搖，使Tween-80完全溶解，即 為水相； (4)油相和水相按照2份：1份混合乳化，即油相2份注入膠體磨中，打開開關攪動油相， 同時緩慢加入水相1份，攪拌轉速由慢到快充分乳化，即完成制備。
【專利摘要】一種雞新城疫弱毒株及其在制備雞新城疫油乳劑滅活疫苗的應用，本發明的目的是提供一種低致病力的雞新城疫病毒，該病毒具有免疫原性好，安全的特性。本發明的技術方案是，一種雞新城疫弱毒株，藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏編號為CGMCC？No.11290。本發明分離得到的毒株是一株免疫原性好、生產性能優良、適宜大規模生產的種毒。由該毒株制備的活疫苗產品質量合格，具備產業化生產的條件。CGMCC No. 1129020151019
【IPC分類】C12N7/00, A61P31/14, A61K39/17, C12R1/93
【公開號】CN105647876
【申請號】
【發明人】趙坤, 徐小博, 徐萍, 劉明成, 王麗榮, 王元元, 李任峰
【申請人】河南科技學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月29日