一種高活力漆酶液的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高活力漆酶液的制備方法。
【背景技術】
[0002]栓菌屬微生物，屬于擔子菌門的白腐真菌(white-rotfungi)。白腐真菌靠降解木質素一纖維素材料的能力穿入木質，侵入木質細胞腔內，釋放降解性酶，導致木質腐爛并呈白色，是降解芳香化合物能力最強的微生物。
[0003]漆酶(EC1.10.3.2)，屬于藍多銅氧化酶(blue multicopper oxidases，MC0s)家族的一種，能夠在氧氣作為電子受體的條件下氧化芳香族化合物，且底物作用特異性低。漆酶不僅可以氧化多酚類芳香族化合物，還可以利用在小分子介體的介導下形成的漆酶/介體體系(LMS)氧化非酚類物質或其它更為復雜的大分子。漆酶可選擇性的去除木質纖維素中的木質素，有效地對偶氮染料進行脫色，還可以去除環境中酚類藥物或其它類似毒性物質。因此，漆酶在生物質能源、紡織、造紙、廢報紙脫墨、食品、生物修復和生物傳感器等領域具有重要的研究和應用價值。
[0004]漆酶廣泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、細菌和昆蟲等物種中也有發現。研究指出高等真菌，尤其是擔子菌門的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生產菌種。白腐真菌主要利用分泌出的過氧化物酶(LiPs、MnPs和漆酶)對木質素進行催化氧化反應，從而降解木質素分子。與其它兩種木質素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一個實現工業化生產和應用的木質素降解酶。白腐真菌的產酶水平一般在幾個至幾十個單位每毫升之間不等，極少能夠達到100U/mL以上，且發酵時間通常在兩周左右，甚至達到一個月之久，使得產酶水平低和產酶周期長成為目前限制漆酶工業化生產和應用的主要瓶頸問題。
[0005]由于搖瓶發酵與工業大生產發酵在發酵級別和發酵工藝方面存在巨大差異，因此工業酶制劑在研發到生產的歷程中，必須經歷一個實驗室逐級放大發酵的過程。小型發酵罐內發酵工藝參數的獲得可為酶發酵的工業放大提供基本參考數據和時間基礎，在酶的工業化生產中具有極其重要的地位。
【發明內容】
[0006]根據以上現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提出一種高活力漆酶液的制備方法，目的是得到較高活力的漆酶液，所生產的漆酶液可以被應用與生物質能源、紡織、食品、生物修復、造紙等方面。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為:
[0008]—種高活力漆酶液的制備方法，包括如下步驟:
[0009 ]步驟一，使用固體斜面活化栓菌以制備斜面種子；
[0010 ]步驟二，將斜面種子在種子培養基中接種培養以制備種子培養液；
[0011 ]步驟三，將種子培養液在發酵培養基中進行發酵產漆酶。
[0012]所述栓菌保藏編號為:CCTCC N0:M2015191，拉丁文名稱為Trametes sp.LS-10C,保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2015年04月03日，保藏地址為中國武漢武漢大學。
[0013]斜面種子的具體制備方法為:將該栓菌的超低溫(-80°C)甘油凍結管保藏管取出，在10?25°C溫度下緩慢回溫并溶解，使用無菌接種環挑取含有栓菌菌絲的保藏液體并劃線固體斜面培養基(500mL茄子瓶裝斜面培養基10mL)，置于30 °C恒溫培養箱內培養3?5d，使栓菌菌絲長度達到5?10_，即可作為斜面種子使用。
[0014]每L斜面培養基含有:土豆浸出汁20mL(取200g 土豆去皮加入800mL水，煮沸0.5h，冷卻后定容到10001^)，葡萄糖208，瓊脂粉208，？!1為6.0。
[0015]所述種子培養基包括一級種子培養基和二級種子培養基，所述斜面種子先接種入一級種子培養基進行液體搖床培養得一級種子培養液，再將一級種子培養液接種入二級種子培養基在發酵罐中進行種子液擴大培養得二級種子培養液。
[0016]—級種子液的具體制備方法為:每個培養好的茄子瓶使用40mL無菌水進行洗滌，吸取30mL洗滌后獲得的菌絲懸液接入270mL無菌的一級種子培養基中，接種后種子培養基裝液量為IL三角瓶裝300mL培養基。接種后置于恒溫震蕩培養搖床中培養，培養溫度為300C，搖床轉速為220rpm，培養48h后，即可作為一級種子液使用。
[0017]每L一級種子培養基含有:酵母浸出物5g，葡萄糖10g，麥芽糖10g，氯化錢3g，蛋白Jt、20g，pH*5.5。
[0018]二級種子液的具體制備方法為:將上述培養好的一級種子液全部接種入裝有無菌二級種子培養基的全自動攪拌式通氣發酵罐，終裝料系數為70?80%，罐壓設定為0.03?
0.06MPa，溫度控制為28?30°C，發酵液pH控制為4.0?6.0，攪拌轉速控制在300?500r/min之間，通氣量控制在0.3?0.6vvm之間，溶解氧濃度控制在30%?50%之間。在上述條件下培養40h后，即獲得二級種子液。
[0019]所述二級培養基的配方為:每L二級種子培養基含有:葡萄糖10g，10%麩皮浸出汁10g，氯化錢5g，酵母粉2g，五水硫酸銅0.1g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀Ig，pH為5.5。
[0020]二級種子培養基中所使用的10%麩皮浸出汁按如下方法配置:準確稱取10g麩皮，加入100mL蒸餾水并煮沸30分鐘后使用4層紗布過濾，過濾液使用蒸餾水定容至I OOOmL，即得所述1 %麩皮浸出汁。
[0021]步驟三中發酵產漆酶具體方法為:將二級種子發酵罐內培養的種子液全部轉入三級發酵罐中。罐壓設定為0.03?0.08MPa，溫度控制為28?30°C，發酵液pH控制為4.0?6.0，攪拌轉速控制在300?700r/min之間，通氣量控制在0.3?0.8vvm之間，溶解氧濃度控制在20%?60%之間。在上述發酵條件下，分別在發酵時間為48h、96h和144h時向發酵罐內加入500mL營養液，發酵培養8d后獲得高活力漆酶液。
[0022]所述發酵培養基的配方為:每L含有麥芽糖、葡萄糖之一或其混合物10?40g，10%麩皮浸出汁80?120g，氯化銨、酒石酸銨、豆柏、豆餅粉之一或其混合物5?10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸銅0.1?0.4g，氯化鈉lg，磷酸二氫鉀2g。
[0023]所述發酵培養基配方中10%麩皮浸出汁配置方法同二級種子制備過程中所使用的方法。
[0024]為了進一步的增強產漆酶的活力，步驟三發酵過程中通過加酸或者加減控制pH為4 ο此時得到的漆酶活力相對較高。
[0025]所述步驟三中還包括在發酵過程中添加營養液，通過添加營養液，能夠使得發酵產漆酶的活力得到很大的提高。
[0026]所述營養液的配方為:每L含有麥芽糖、葡萄糖、蔗糖之一或其混合物300?450g，五水硫酸銅O?20g，硝酸銨、硝酸鉀或其混合物50?100g，吐溫-80 2?5g。
[0027 ]從所述步驟三中漆酶培養過程中每24h從發酵液中放出50mL液體并對其漆酶活力進行測定，發酵Sd后發酵液中的漆酶活力達到970U/mL以上；
[0028]漆酶活力的檢測方法為:
[0029]底物溶液:使用0.1M，pH 4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液配置0.5mM ABTS(2，2二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液，即為漆酶活力測定底物溶液；
[0030]粗酶液處理:吸取0.5mL發酵液于1.5mL離心管中，在室溫條件下使用高速離心機(12000r/min)離心lOmin，吸取上清0.5mL并使用0.1Μ，ρΗ 4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液稀釋至1000?500011^，即得到粗酶液；
[0031]酶促反應體系:分別將底物溶液和反應粗酶液置于40°C恒溫水浴鍋中預熱5min后，吸取1.5mL反應粗酶液加入1.5mL底物溶液中，立即充分混勻并分別記錄在O至60秒、61至120秒、121秒至180秒內反應液在420nm處吸光值的變化，以上述3次測定的吸光值變化值的平均值記為反應體系平均每min吸光值的變化值；
[0032]漆酶活力定義:在上述酶促反應條件下，定義Imin內氧化Ιμπιο?ABTS所需要的酶量為一個漆酶活力單位(U)，并將漆酶發酵活力表示為U/mL。
[0033]本發明有益效果是:
[0034]1.菌體對溶解氧濃度適應范圍廣，發酵工藝參數易于控制；
[0035]2.發酵pH適應范圍廣，工藝控制簡單；
[0036]3.采用逐級放大發酵，主體發酵周期短，節省發酵能耗；
[0037]4.利用銅離子誘導和補加營養液，顯著提升漆酶發酵活力；
[0038]5.重復發酵性能穩定，發酵活力高達900U/mL以上；
[0039]6.為栓菌漆酶的工業放大奠定基本工藝參數。
[0040]7、所生產的漆酶液可以被應用與生物質能源、紡織、食品、生物修復、造紙等方面。
【附圖說明】
[0041]下面對本說明書附圖所表達的內容及圖中的標記作簡要說明:
[0042]圖1是栓菌在不同pH條件下產漆酶活力值；
[0043]圖2是本發明的實施例5中栓菌產漆酶發酵曲線。
[0044]圖中: