一個參與dmnt和tmtt生物合成的cyp450基因及其編碼產物與應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于植物分子生物學領域，特別涉及DMNT和TMTT化合物合成相關的蛋白， 編碼其的基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 在植物的眾多化合物中，有一些是揮發性物質。植物揮發物在植物抵御蟲害的過 程中發揮著重要的作用。當植物受到害蟲的危害之后，植物會感知到，并通過合成釋放揮發 性物質來趨避害蟲或引誘植食性昆蟲的天敵來減輕害蟲危害，從而提高植物的抗蟲性。萜 烯類揮發物包括單萜類，倍半萜類，二萜類和萜烯同系物(E)-4,8-二甲基-1，3,7-壬三烯 ((E)-4，8-dimethy 1 -1，3，7-nonatriene，DMNT)和（E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳 四烯（（E，E)-4，8，12-trimethy ltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT)等。DMNT 和 TMTT 是植物 花香揮發物和害蟲誘導揮發物中最常見的一類，這兩種物質在單子葉植物和雙子葉植物中 廣泛存在，包括楊樹和胡桃樹等樹種，還有玉米、擬南芥、棉花、利馬豆、黃瓜、番茄和大白菜 等作物。DMNT和TMTT在生態系統能吸引多種害蟲的寄生性天敵和捕食性天敵，如智利小植 綏螨、微紅盤絨繭蜂和盔奧嚙小蜂等。此外，DMNT和TMTT能誘導或預警未被危害的鄰近植物 或同一植物內的防御反應。
[0003] DMNT和TMTT的前體分別為(E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉基芳樟醇。但是，把橙花叔 醇和香葉基芳樟醇轉化為DMNT和TMTT的關鍵酶很久都未解決。氘標記的代謝物探針研究表 明叔醇通過碳碳骨架溝的氧化反應而形成萜烯同系物。通過擬南芥的共表達數據庫鑒定出 一批在多種壓力脅迫下與香葉基芳樟醇合成酶基因共表達的P450基因，該方法結合對誘導 處理葉片的RT-PCR研究，鑒定到一個候選的P450基因。通過酵母表達和對擬南芥突變體株 系的回補實驗研究，發現植物的CYP82家族成員CYP82Gl(At3g25180)負責著擬南芥TMTT的 合成。
[0004] CYP450酶為血紅蛋白結合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一個保守的血紅 素結合域，是鑒定該基因的一個重要特征。擬南芥基因組中有272個CYP450基因，擬南芥基 因組注釋顯示有457個CYP450基因，如此龐大的基因家族反映了植物次生代謝物的復雜多 變。各種CYP450酶催化的反應廣泛并且復雜，包括羥基化、N-、0-和S-端的脫烷基化、環氧基 化、脫氨基作用、脫硫、脫鹵作用和過氧化反應等。盡管催化反應各異，催化機理卻相同，即 通過NADPH或者NADH為CYP450傳遞電子，激活氧分子，將其中的一個氧插入到底物上，同時 生成一分子水。CYP450酶作為萜類、黃酮類、脂肪酸類和植物激素等合成代謝途徑的一類重 要酶蛋白，不但催化相關代謝反應，由于大多數的CYP450蛋白均有一段內質網膜定位蛋白， 因此在代謝區室(Metabolon)的酶復合體中還具有固定酶復合體的作用。隨著分子生物學 以及相關檢測技術的不斷發展，次生代謝途徑相關的CYP450基因功能逐漸得以驗證。真核 表達、原核表達以及RNA干擾(RNA Interference)等技術在CYP450基因的功能驗證中發揮 了重要作用。近年來利用真核表達使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物揮發物等代謝途徑 中的重要作用逐漸被解析。但是作為在植物次生代謝中發揮作用的CYP450表達量相對較 低，并且大多C Y P 4 5 0蛋白具有嚴格的催化底物結構特異性，同時基因組中廣泛存在的 CYP450基因為次生代謝相關基因的克隆和功能驗證提供了難度，使之成為了近年來國際學 術界的研究熱點之一。
[0005] 到目前為止DMNT和TMTT合成通路只有在擬南芥中被解析。在其他物種中的研究尚 停留在化合物鑒定和行為學研究方面，尚未有IMNT和TMTT合成通路基因被報道。特別是在 農業生產中重要的植物，如蔬菜和農作物等方面的研究更為有限，這限制了我們對于DMNT 和TMTT合成通路的認識，也限制了 DMNT和TMTT在綠色農業生產中的應用。這極大的限制了 DMNT和TMTT在農作物中的應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一個立馬豆DMNT和TMTT生物合成代謝途徑的CYP450基因 P1CYP82，其編碼的蛋白在含有NADPH的緩沖體系中能催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉基芳 樟醇生成DMNT和TMTT。
[0007] 本發明提供了一種與DMNT和TMTT合成代謝有關的基因 P1CYP82,它是序列表中SEQ ID N〇:l所示的DNA序列。以及一種由上述基因 CYP450編碼的蛋白質，具有序列表中SEQ ID No: 2的氨基酸殘基序列以及具有SEQ IDNo. 2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNo. 2 衍生的蛋白質。
[0008] 本發明SEQ ID No. 1的DNA序列由1713個堿基組成，其中71-1657的堿基編碼528個 氨基酸殘基組成的蛋白質序列SEQ ID No.2。
[0009] 含有本發明基因 P1CYP82的表達載體、細胞系及宿主菌和使用該基因在調節和生 產植物DMNT和TMTT化合物及植物抗蟲育種中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0010] 將SEQ ID No.l基因克隆到真核表達載體PYES2的限制性內切酶BamH I和Nhel位 點間，構建帶有P1CYP82基因的重組表達載體PESC-TRP-P1CYP82;轉入酵母菌株WAT21表達 宿主菌采用半乳糖誘導表達。通過提取表達菌株微粒體，加入到以(E)-橙花叔醇和(E，E)_ 香葉基芳樟醇為底物的體外酶促反應體系中，正己烷萃取反應產物，GC-MS分析。GC-MS分析 結果表明（E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉基芳樟醇在P1CYP82蛋白酶的催化下，生成了新的物 質，通過分析新產物的分子離子峰與DMNT和TMTT標樣對比，認為該產物為DMNT和TMTT。
[0011] 研究結果表明，本發明與立馬豆DMNT和TMTT合成有關的基因具有細胞色素 P450基 因的特征結構域，酶促反應分析發現該基因催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香葉基芳樟醇形成 防御性揮發物DMNT和TMTT，對于調節和生產植物DMNT和TMTT揮發物及培育新的抗蟲作物具 有重要的理論及實際意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1.立馬豆P1CYP82基因的PCR克隆
[0013] M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產物
[0014] 圖2.重組質粒 pESC-TRP-PlCYP82 的 PCR 鑒定
[0015] M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產物
[0016] 圖3.利馬豆P1CYP82基因在酵母中反應產物的GC-MS圖
[0017] P1CYP82 基因以（E)-Nerolidol 和(E，E)-Geranyllinalool 為底物的酵母反應產物 (A和C);空載體以（E)-Nerolidol和^3)-66抑1^111的1〇〇1為底物的酵母反應產物(8和 D);1.DMNT;2. (E)-Nerolidol;3.TMTT;4. (E，E)-Geranyllinalool;E:DMNT產物質譜圖；F: DMNT標樣質譜圖;G:DMNT產物質譜圖;H:TMTT標樣質譜圖。
[0018] 圖4.轉P1CYP82擬南芥的分子檢測
[0019] M: DL2000marker · 1-3是擬南芥轉基因陽性植株，4是野生型擬南芥，5是GK377A01 擬南芥植株。
[0020] 圖5.過表達P1CYP82基因、野生型和GK377A01擬南芥植株的揮發物分析
[0021] A:過表達P1CYP82基因擬南芥植株;B:野生型擬南芥植株;C: GK377A01擬南芥植 株;D:TMTT標樣。
[0022] 圖6.過表達P1CYP82基因、野生型和GK377A01擬南芥植株的TMTT釋放量
[0023] A:過表達P1CYP82基因擬南芥植株;B:野生型擬南芥植株;C: GK377A01擬南芥植株
[0024]圖7.小菜蛾絨繭蜂雌蟲對過表達P1CYP82基因擬南芥植株和野生型擬南芥植株的 選擇
[0025]具體實施例方式
[0026] 實施例1.立馬豆總RNA的提取和cDNA的合成
[0027] 立馬豆的總RNA的提取參照天根生化科技有限公司RNA simp 1 e總RNA提取試劑盒 中的說明手冊提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測并通過NanoDrop測定濃度。cDNA第一鏈的合成采 用TAKATA公司的primer scriptTM 1st strand cDNA Synthesis System反轉錄試劑盒，方 法參照試劑盒中的說明手冊。同時，為了獲得基因全長，用SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒， 進行cDNA的合成，方法參照試劑盒中的說明手冊。
[0028]實施例2.引物設計與基因克隆
[0029] 根據擬南芥CYP82基因（at3g25180)，在菜豆基因組網站http:// phytozome. jgi . doe. gov/pz/portal .html# ； ! info?alias = 0rg_Pvulgaris VI · 0上進行 blast，獲得立馬豆CYP基因部分保守序列。根據該基因的序列設計保守引物，通過RACE技術 在克隆立馬豆中的同源基因。5RACE primerl :TCCTGAAATAGGGTATTCTAGCATT;5RACE primer2:CGGGT