[0045]1、還原糖消耗曲線;2、菌體生長曲線;3、漆酶發酵活力曲線。
【具體實施方式】
[0046]下面對照附圖，通過對實施例的描述，本發明的【具體實施方式】如所涉及的工作原理、制造工藝及操作使用方法等，作進一步詳細的說明，以幫助本領域技術人員對本發明的發明構思、技術方案有更完整、準確和深入的理解。
[0047]本發明利用全自動攪拌式通氣發酵罐，通過控制溶解氧(或PH、溫度、罐壓力、攪拌轉速)，以酒石酸氨(或豆柏、氯化銨、豆餅粉)為氮源，以麩皮汁(或麥芽糖、葡萄糖)等為碳源，以硫酸銅為產酶誘導因子經液態發酵生產高活力漆酶液。具體實施例如下:
[0048]實施例1
[0049]將該栓菌的超低溫(-80°C)甘油凍結管保藏管取出，在20°C溫度下緩慢回溫并溶解，使用無菌接種環挑取含有栓菌菌絲的保藏液體并劃線固體斜面培養基(500mL茄子瓶裝斜面培養基10mL)，置于300C恒溫培養箱內培養4d，使栓菌菌絲平均長度達到6mm左右，使用40mL無菌水進行洗滌，吸取30mL洗滌后獲得的菌絲懸液接入270mL無菌的一級種子培養基中，接種后種子培養基裝液量為IL三角瓶裝300mL培養基。接種后置于恒溫震蕩培養搖床中培養，培養溫度為30°C，搖床轉速為220rpm，培養48h后獲得一級搖瓶種子液。將上述培養好的一級種子液全部接種入裝有2.1L無菌二級種子培養基的全自動攪拌式通氣發酵罐，發酵罐總體積為3L，終裝料系數為80 % (裝液量為2.4L)，罐壓設定為0.04MPa，攪拌轉速控制在400r/min，通氣量控制在0.5vvm，溶解氧濃度控制在40 %，溫度控制在30°C，發酵液pH控制在5.0。在上述條件下培養40h后，即獲得二級種子液。
[0050]在總容積為30L的全自動通氣式發酵罐內裝入21L發酵培養基，并將3L二級種子液全部轉接入發酵罐內，使接種后總裝料體積為24L，即裝液量為80%。發酵過程中，罐壓設定為0.05MPa，攪拌轉速控制在500r/min之間，通氣量調節為0.5vvm，將溶解氧濃度控制在40 %左右，溫度控制在30°C，使用10%氨水或5 %磷酸將發酵液pH控制在4.0。在上述發酵條件下，分別在發酵時間為48h、96h和144h時向發酵罐內加入500mL營養液，發酵培養9d后獲得活力為930U/mL的漆酶液，如圖1所示。
[0051]每L一級種子培養基含有:酵母浸出物5g，葡萄糖10g，麥芽糖10g，氯化銨3g，蛋白Jt、20g，pH*5.5。
[0052]每L二級種子培養基含有:葡萄糖10g，10%麩皮浸出汁100g，氯化銨5g，酵母粉2g，五水硫酸銅0.1g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀Ig，pH為5.5。
[0053]每L發酵培養基含有:葡萄糖20g，麥芽糖1g,10%麩皮浸出汁120g，氯化銨5g，酒石酸錢Ig，豆柏5g，酵母粉2g，五水硫酸銅0.2g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀2g。
[0054]每L營養液含有:葡萄糖300g，麥芽糖100g，五水硫酸銅20g，硝酸鉀20g，硝酸銨10，吐溫-80 2go
[0055]實施例2
[0056]本實施例與實施例1的不同點在于，將實施例1中發酵產漆酶過程中的發酵液pH控制在6.0，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為860U/mL的漆酶液，如圖1所示。
[0057]實施例3
[0058]本實施例與實施例1的不同點在于，在總容積為30L的全自動通氣式發酵罐內裝入18L發酵培養基，并將3L二級種子液全部轉接入發酵罐內，使接種后總裝料體積為21L，即裝液量為70%。其它工藝條件均不變。
[0059]發酵培養9d后獲得活力為950U/mL的漆酶液。
[0060]實施例4
[0061]本實施例與實施例1的不同點在于，發酵產漆酶過程中發酵罐的罐壓設定為
0.06MPa，通氣量控制在0.5vvm，通過調節攪拌轉速(300?700r/min)將溶解氧濃度控制在10%，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為910U/mL的漆酶液。
[0062]實施例5
[0063]本實施例與實施例1的不同點在于發酵培養基組分的不同，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為970U/mL的漆酶液。發酵產漆酶的發酵曲線如圖2所示。
[0064]每L發酵培養基含有:葡萄糖25g，麥芽糖I，5g，10%麩皮浸出汁10g，氯化銨5g，酒石酸錢Ig，豆柏5g，酵母粉2g，五水硫酸銅0.5g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀2g。
[0065]實施例6
[0066]本實施例與實施例5的不同點在于，發酵過程中，在發酵培養基中添加的營養液組分不同，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為820U/mL的漆酶液。
[0067]每L營養液含有:葡萄糖400g，硝酸鉀30g，吐溫-802g。
[0068]實施例7
[0069]本實施例與實施例5的不同點在于，發酵過程中，在發酵培養基中不添加營養液，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為650U/mL的漆酶液。
[0070]實施例8
[0071]本實施例與實施例5的不同點在于，發酵過程中，在發酵培養基中不通過加酸/堿控制pH，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為950U/mL的漆酶液。
[0072]實施例9
[0073]本實施例與實施例5的不同點在于，在發酵培養基中不添加硫酸銅，其它工藝條件不變。發酵培養9d后獲得活力為260U/mL的漆酶液。
[0074]上面對本發明進行了示例性描述，顯然本發明具體實現并不受上述方式的限制，只要采用了本發明的方法構思和技術方案進行的各種非實質性的改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直接應用于其它場合的，均在本發明的保護范圍之內。本發明的保護范圍應該以權利要求書所限定的保護范圍為準。
【主權項】
1.一種高活力漆酶液的制備方法，包括如下步驟: 步驟一，使用固體斜面活化栓菌以制備斜面種子； 步驟二，將斜面種子在種子培養基中接種培養以制備種子培養液； 步驟三，將種子培養液在發酵培養基中進行發酵產漆酶。2.根據權利要求1所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述栓菌保藏編號為:CCTCC N0:M2015191o3.根據權利要求1所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述種子培養基包括一級種子培養基和二級種子培養基，所述斜面種子先接種入一級種子培養基進行液體搖瓶培養得一級種子培養液，再將一級種子培養液接種入二級種子培養基在發酵罐中進行種子液擴大培養得二級種子培養液。4.根據權利要求3所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述二級培養基的配方為:每L二級種子培養基含有:葡萄糖10g，10%麩皮浸出汁100g，氯化銨5g，酵母粉2g，五水硫酸銅0.1g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀lg。5.根據權利要求3所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:制備所述二級種子培養液的發酵罐發酵工藝參數為:終裝料系數為70?80%，罐壓設定為0.03-0.06MPa，溫度控制為28?300C，攪拌轉速控制在300?500r/min之間，通氣量控制在0.3?0.6vvm之間，溶解氧濃度控制在30 %?50 %之間。6.根據權利要求3所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:步驟二和步驟三的發酵過程中控制pH=4?6。7.根據權利要求1所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:步驟三中發酵的工藝參數為:罐壓設定為0.03?0.08MPa，溫度控制為28?30°C，攪拌轉速控制在300?700r/min之間，通氣量控制在0.3?0.8vvm之間，溶解氧濃度控制在20 %?60 %之間。8.根據權利要求1所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述發酵培養基的配方為:每L含有麥芽糖、葡萄糖之一或其混合物10?40g，10 %麩皮浸出汁80?120g，氯化銨、酒石酸銨、豆柏、豆餅粉之一或其混合物5?10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸銅0.1?0.4g，氯化鈉Ig，磷酸二氫鉀2g。9.根據權利要求1所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述步驟三中還包括在發酵過程中添加營養液。10.根據權利要求9所述高活力漆酶液的制備方法，其特征在于:所述營養液的配方為:每L含有麥芽糖、葡萄糖、蔗糖之一或其混合物300?450g，五水硫酸銅O?20g，硝酸銨、硝酸鉀或其混合物50?10g，吐溫-80 2?5g。
【專利摘要】本發明公開了一種高活力漆酶液的制備方法，包括如下步驟：步驟一，使用固體斜面活化栓菌以制備斜面種子；步驟二，將斜面種子在種子培養基中接種培養以制備種子培養液；步驟三，將種子培養液在發酵培養基中進行發酵產漆酶。所獲高活力漆酶液的發酵制備工藝簡單、穩定，具有周期短、重復性好等特點，所生產的漆酶液可以被應用與生物質能源、紡織、食品、生物修復、造紙等方面。CCTCC NO：M201519120150403
【IPC分類】C12N9/02, C12R1/645
【公開號】CN105647881
【申請號】
【發明人】李松, 湯斌, 陳阿娜, 劉宇, 楊倩
【申請人】安徽工程大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日