Cas9融合蛋白及其編碼序列的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，涉及一種融合蛋白及編碼融合蛋白的DNA序列。 技術背景
[0002] 動物疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關鍵作用。非人靈長 類動物在生物學、遺傳學上與人類高度相似，如獼猴與人類基因組同源性高達93% (Gibbs et al.，2007)，因而成為人類重大疾病研究和藥物篩選的重要動物模型。然而，由于缺乏大 動物的胚胎干細胞系，傳統的基因打靶技術難于用來建立靈長類動物疾病模型。而近年來 發展的基因編輯新技術CRI SPR/Cas9在定向對基因進行精確修飾上展現出了巨大的潛力， 已被廣泛用于不同種屬進行基因組改造和基因修飾。同時，該新型技術也被嘗試用來治療 一些因基因缺陷導致的疾病（Schwank et al.，2013;Wu et al. ,2013)。然而，CRISPR/Cas9 技術在基因修飾的精準度上仍有待于提高。
[0003] CRISPR/Cas9是一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導Cas蛋白對基因進行編輯 和修飾的新技術。Jinek等對CRISPR/Cas9系統進行人工改造使得該系統能夠更簡單方便地 用于基因編輯(Jinek et al.，2013)<XaS9內切酶在向導RNA分子的引導下對特定位點的 DNA進行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會借助同源重組機制或者非同源末端連接機制 對斷裂的DNA進行修復。若細胞通過同源重組機制進行修復，會用另外一段DNA片段填補斷 裂的DNA缺口，因而會引入一段"新的"遺傳信息。目前，RNA介導的Cas9系統能夠成功介導細 菌、植物細胞、斑馬魚胚胎、小鼠、人源細胞、非人靈長類動物食蟹猴胚胎、甚至人類廢棄胚 胎等的基因組編輯（Cho et al.，2013;Cong et al.，2013;Jinek et al.，2013;Mali et al.,2013；Niu et al.,2014；Platt et al.,2014；Shan et al.,2013；Chen et al., 2015)。且該技術還可通過基因敲入成功糾正疾病動物的缺陷基因 （Schwank et al., 2013; Wu et al. ,2013)或者改組為病毒載體建立癌癥動物模型(Platt et al. ,2014)等，先前的 研究成果都為該技術未來應用于人類遺傳缺陷疾病的治療提供了希望。
[0004] CRISPR/Cas9系統的飛速發展使得動物疾病模型的建立不再局限于少數的模式生 物，使得在所有物種中實現基因組編輯成為可能。該技術使用方便、簡單且打靶效率較高， 能夠實現將一對等位基因進行剪切得到純合突變，還可在目的基因的多個位點設計多種 gRNA以達到完全敲除目的。但該技術目前也存在潛在基因突變嵌合多態性、脫靶效應、基因 敲入同源重組效率較低等不足之處。針對基因打靶的嵌合效應問題，由于小動物模型生長 周期較短，可通過胚胎干細胞篩選或不斷雜交傳代而得到純合突變體，但對于與人類較為 接近的靈長類動物而言，其性成熟時間就需要4到5年，妊娠時間高達165天，且目前尚缺乏 猴胚胎干細胞系，因此嵌合效應在建立純合基因突變猴模型上具有巨大挑戰性。
[0005] 嵌合突變效應的發生可能由于注射的Cas9mRNA和sgRNA在受精卵胚胎分裂后仍持 續表達，且注射Cas9蛋白也出現此嵌合現象（Platt et al.，2014;Sung et al.，2014) (Sung YH，2014;Kim S，2014)，表明Cas9蛋白在細胞內的半衰期較長從而導致受精卵細胞 分裂成四細胞、八細胞甚至囊胚時期時，每個細胞因隨機分配不同程度的Cas9蛋白而形成 不同程度的多種基因修飾類型，所形成的胚胎組織及新生的動物會在不同的細胞或組織中 攜帶不同的基因修飾類型或有不同程度(單鏈或雙鏈DNA)的基因修飾。此外，細胞自身的 DNA損傷修復機制或DNA非同源重組修復等也會影響基因打靶效率及嵌合效應。
[0006] 在原核和真核生物體內的每種蛋白質都有其壽命特征，又稱為半衰期。蛋白質的 半衰期與其多肽鏈N-端特異的氨基酸有關，即N-端法則(Bachmair et al. ,1986)。因此可 利用N-端法則和帶有不同種類氨基酸的泛素融合蛋白（ubiquitin fusion degradation, UFD)降解信號來改變依賴于泛素化降解途徑的蛋白質半衰期，比如N端連有Arginine(Ub-R-trageted protein)，Leucine(Ub_L-trageted protein)，Proline(Ub_P-trageted protein)或者Lys(Ub_K-trageted protein)會明顯降低目的蛋白的穩定性從而加速降 解，而連有Met,Ser,Ala則使得目的蛋白更加穩定(Johnson et al. ,1995)。且符合N-端規 則的蛋白其降解依賴于第15位或者17位的氨基酸為賴氨酸，因此可在去穩定降解信號和目 的蛋白之間插入一段隨機氨基酸序列使得目的蛋白的賴氨酸出現在第十七位。而在連接去 穩定降解信號和目的蛋白之間的linker上的第三位若為賴氨酸則可進一步增強泛素化效 率（Bachmair et al.，1986;Dantuma et al·,2000)。
【發明內容】
[0007] 本發明目的在于提供一種Cas9融合蛋白、其編碼序列、含有編碼序列的質粒及表 達載體。
[0008] 本發明提供的Cas9融合蛋白包括Cas9片段及Ubiquitin片段。Ubiquitin與Cas9的 連接子第1位氨基酸不同可獲得不同的實驗效果。所述的Ubiquitin為Ubiquitin-L、 Ubiquitin-P或Ubiquitin_R(L，P，R為Ubiquitin與Cas9的連接子第1位氨基酸的縮寫）。
[0009] 通過質粒改造的方式將Ubiquitin的DNA編碼序列連接至Cas9的DNA編碼序列上， 從而達到加速Cas9蛋白降解的效果。Ubiquitin與Cas9的連接子第1位氨基酸不同可獲得不 同的實用效果，通過測試我們發現Ubiquitin_R(R表示Ubiquitin與Cas9的連接子第1位氨 基酸為精氨酸)效果最佳，Ubiquitin_L、Ubiquitin^^：^2。
[00?0] 在本發明的一個優選的實施方案中，Ubiquitin為Ubiquitin-R。
[0011]作為優選的實施例，所述的融合蛋白含有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。發明同 時提供了一種Cas9融合蛋白編碼序列，其特征在于含有Cas9 DNA片段及Ubiquitin DNA片 段。
[0012] 通過測試我們發現111^911；[1:;[11-1?(1?表示1]13丨911；[1:;[11與0389的連接子第1位氨基酸為 精氨酸)效果最佳，Ubiquitin_L、Ubiquitin^^：^2。
[0013] 在本發明的一個優選的實施方案中，所述的Ubiquitin為Ubiquitin-R。
[0014] 作為優選的實施例，所述的編碼序列含有如SEQ ID NO.2所示DNA序列。
[0015] 發明同時提供了包含上述編碼序列的質粒、表達載體、或宿主細胞;優選地，所述 的載體為 Ubiquitin-R_Cas9。
[0016] -種基因打靶方法，利用所述融合蛋白或所述編碼序列進行基因打靶。優選地，所 述基因為哺乳動物基因；更優選地，所述基因為非人類哺乳動物基因；進一步優選地，所述 基因為非人類靈長類動物基因。
[0017] -種降低動物細胞基因打靶嵌合效應的方法，其利用上述融合蛋白或編碼序列進 行基因打靶;優選地，所述的細胞為哺乳動物細胞;更優選地，所述的細胞為非人類哺乳動 物細胞;進一步優選地，所述的細胞為非人類靈長類動物細胞
[0018] 作為本發明的一種實施方式，本發明提供了一種顯著降低CRISPR/Cas9在非人靈 長類動物食蟹猴基因打靶嵌合效應的新方法：即通過添加泛素化降解信號Ubiquitin縮短 Cas9蛋白的半衰期以定量控制其僅在受精卵發育早期（二細胞時期或者四細胞時期)發揮 基因打靶作用。
[0019] 在本發明一個特別優選的實施例中，公開了一種含有Ubiquitin特異降解信號的 Cas9蛋白序列的改造載體及其在靈長類動物食蟹猴中的應用。具體包括:制備上述改造后 的Cas9蛋白序列、構建改造后的質粒載體;設計特異性識別、切割食蟹猴基因組指定位點序 列的基因組