編輯工具sgRNA，使用共顯微注射的方法將所述基因組編輯工具sgRNA、所述改 造前(WT-Cas9)和改造后(Ub-i-Cas9)的質粒載體經體外轉錄生成的Cas9mRNA導入猴單細 胞受精卵胚胎，利用單卵裂球分離技術及優化的單細胞PCR技術鑒定基因打靶效率、純合突 變效率。
[0020]在下文中，以Ubiquitin-i表不Ubquitin-L、Ubquitin_P或Ubquitin-R任意一種。
[0021] 基于CRISPR/Cas9介導基因打靶方法，利用本發明提供的融合蛋白進行基因打靶， 可以解決CRISPR/Cas9技術存在的基因打靶嵌合效應的問題。我們將此方法具體應用在敲 除食蟹猴PINKl，Parkin和ASPM基因的載體構建過程中。我們的實驗包括1)改造前Cas9蛋 白表達載體MLM3613_Cas9,2)改造后Ubiquitin-i_Cas9蛋白表達載體和攜帶有PINK1， Parkin和ASPM基因打靶序列的sgRNA表達載體;3)以及使用共具顯微注射的方法將所述基 因組編輯工具{包括：sgRNA、由所述改造前(WT-Cas9)和改造后(Ub-i-Cas9)的質粒載體經 體外轉錄生成的Cas9mRNA}導入猴單細胞受精卵胚胎;4)利用單卵裂球分離技術及優化的 單細胞PCR技術鑒定基因打靶效率、純合突變效率。
[0022] 由于嵌合效應的發生與注射后所表達的Cas9蛋白較長的半衰期具有重要聯系。通 過本發明的方法能夠實現在不影響Cas9切割效率的同時通過縮短Cas9蛋白半衰期以定量 定時控制其僅在受精卵胚胎發育早期發揮基因打靶作用，從而減少嵌合突變效應，對高效 建立非人靈長類動物純合突變的疾病模型以及基因缺陷修復治療具有重要意義。
[0023]本發明一方面可以使得Cas9蛋白在胚胎細胞中發揮打靶作用之后迅速降解，從而 降低了胚胎發育的嵌合突變效應。尤其是特別優選的Ubiquitin-R-Cas9蛋白，純合打靶突 變率比野生型Cas9提高了3.51倍。
[0024]更重要的是，本發明所提供的UbiqUitin-i-Cas9蛋白可以提高胚胎基因打靶純合 性。尤其是特別優選的UbiqUitin-R-Cas9蛋白，其對野生型Cas9蛋白胚胎基因打靶純合性 效率提高了 350%。這是技術人員預期之外的。
[0025]與現有技術相比，本發明的重要性在于：
[0026]第一，本發明公開了一種含有Ubiquitin特異降解信號的Cas9蛋白序列的改造載 體及其在靈長類動物食蟹猴中的應用，實驗證明該改造后的Cas9能夠對PINKl，Parkin和 ASPM基因進行有效基因打靶，打靶率高達73.83 % ;并且，與WT-Cas9(8.25 % )比較，改造后 的Ub-R-Cas9基因打靶純合突變率高達28.97%，其純合打靶突變率比WT-Cas9提高了3.51 倍。
[0027]第二，利用整個胚胎的基因組DNA并不能精確分析Cas9打靶后胚胎中各個細胞的 嵌合突變類型和突變率，本發明將注射有打靶RNA的四細胞或者八細胞胚胎分離出單卵裂 球，并利用單細胞PCR技術更為精確地分析鑒定同一胚胎來源的不同細胞突變狀況和突變 率，可靠地證實了 Ubiquitin-Cas9融合蛋白在提高打靶純合突變率方面的顯著效果。
[0028]第三，為驗證本發明所使用的Ub-i_Cas9蛋白因快速降解能力使得受精卵發育至 四細胞或者在該時期更早之前便不再發揮打靶作用，本發明利用胚胎單卵裂球分離技術將 四細胞胚胎分離而來的單卵裂球再次培養發育為四細胞時進行單細胞PCR，鑒定結果進一 步證明Ub-i-Cas9的快速降解可保證四細胞胚胎后期的基因修飾類型的均一性。
[0029]本發明所提供的Ub-i_Cas9的使用能夠明顯降低CRISPR/Cas9所介導的基因打靶 嵌合效應，提高其基因修飾精準度，為基因缺陷修復治療及為高效建立具有純合突變的大 動物模型提供了新方法，具有潛在的重要經濟價值和意義。
【附圖說明】
[0030]圖1為包含有不同氨基酸降解信號（黑體)的Ub-i-Cas9結構示意圖。
[0031] 圖2為Ub-i_Cas9質粒構建流程圖。
[0032] 圖3為Ub-i-Cas9在293細胞中的表達及半衰期檢測；其中，A.Ub-i-Cas9在293細胞 中的表達;B. WT-Cas9和UbR-Cas9半衰期;C.圖B的相對定量統計。
[0033] 圖4為WT_Cas9和Ub-R_Cas9在食蟹猴胚胎中的表達;其中，a.WT_Cas9和Ub-R_Cas9 在食蟹猴胚胎中的表達;b. Ub-R-Cas9在293細胞中基因打靶PCR鑒定及測序結果。
[0034] 圖5為WT_Cas9和Ub-R_Cas9在食蟹猴胚胎中的Parkin基因打靶效率比較；其中， a. WT_Cas9和Ub-R_Cas9在食蟹猴胚胎中打靶效率統計表;b. WT_Cas9和Ub-R_Cas9在食蟹猴 胚胎中打靶的PCR代表性結果;c. Ub-R-Cas9在食蟹猴胚胎中打靶測序結果。
[0035]圖6為單細胞PCR酶切鑒定打靶結果;注射有WT_Cas9和Ub-R_Cas9的受精卵胚胎細 胞發育至四細胞時期經單卵裂球分離再培養發育成新四細胞后所分離的單細胞。
【具體實施方式】
[0036] 以下對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不局限于以下的實施例介紹， 凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的范疇。
[0037] 發明涉及的泛素蛋白降解信號Ubiquitin-R-myc序列如SEQ ID N0.3;Ubiquitin-R序列如SEQIDN0.4;Myc序列如SEQIDN0.5;Cas9蛋白序列如SEQIDN0.6。
[0038] 在具體的實施例中編碼本發明的Ubquitin-R-Cas9融合蛋白的編碼序列如SEQ ID N0·2·而Ubquitin-L-Cas9、Ubquitin-P-Cas9則是SEQIDN0·2·第229~231位上的cgc分別 替換為cuc、ccc〇
[0039] 實施例1
[0040] 構建包含不同蛋白降解信號的目的質粒Ub-i_Cas9(i代表R，L，P)表達載體，示意 圖如圖1，所述構建流程方法如下（圖2)。
[0041 ]為便于構建，首先用 MLM3613Cas9(Addgene，Plasmid#42251,稱為 WT-Cas9)骨架質 粒上的Notl和EcoRI的兩酶切位點將含有T7啟動子、Ncol克隆酶切位點、翻譯起始位點和部 分Cas9蛋白序列的片段剪切后連接在pGEX4T-l質粒上（圖2a，b)，pGEX4Tl-NotI-T7-NcoI-Ca S9-ECORI-。隨后，設計帶有N0?酶切位點以及T7啟動子序列I的上游引物和帶有My C-標 簽序列、L/P/L位點以及Noel酶切位點的下游引物（序列分別如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO. 23-25所示），在下游引物同時引入L/P/R氨基酸的DNA序列，從HEK293細胞eDNA中擴增出 Ubiquitin序列；，將T7-Ubiquitin_L/P/R-myc(由人HEK293細胞eDNA中擴增)序列通過Notl 和Ncol克隆酶切位點連接到pGEX4Tl-NotI-T7-NcoI-Cas9-EcoRI-載體，如圖2c，2d。再將 NotI-T7-ubiquitin_L/P/R-Myc tag-Cas9_EcoRI-片段再連接到用Notl和EcoRI兩酶切位 點線性化的趾13613-〇389骨架質粒，成功構建了1^911；[1:;[11-1?凡/?-]\15^七38-〇389表達載體 (圖 2e)。
[0042] SEQ ID N0.22:Ub 5'-lNotl:5'-ATCCGCGGCCGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGCC ATGCAGATCTTCGTGAAGAC-3' T7promoter
[0043] 3'Primers:
[0044] Ub R 3'-204Ncol(SEQ ID N0.23):
[0045] 5 '-ATCCATGGTCTTAGCATGTACCAGATCTTCTTCAGAAATAAG
[0046] TTTTTGTTCTTTACCTCGCCCACCTCTGAGACGGAG-3 '
[0047] Ub L3'-204Ncol(SEQ ID N0.24):
[0048] 5 '-ATCCAT