GGTCTTAGCATGTACCAGATCTTCTTCAGAAATAAG
[0049] TTTTTGTTCTTTACCTAGCCCACCTCTGAGACGGAG-3 '
[0050] Ub P 3，-204Ncol(SEQ ID N0.25):
[0051 ] 5 '-ATCCATGGTCTTAGCATGTACCAGATCTTCTTCAGAAATAAG
[0052] TTTTTGTTCTTTACCTGGCCCACCTCTGAGACGGAG-3 '
[0053] 構建好的含有Ub-i_Cas9的表達質粒載體使用引物擴增法對其序列進行測序驗 證，測序結果驗證了構建成功。
[0054] 實施例2
[0055] 構建含有PINK1，Parkin和ASPM基因靶序列的CRISPR/Cas9的sgRNA載體。
[0056] 表1.靶序列位點
[0057]
[0058]注:劃線部分序列為sgRNA的PAM序列，即其與目標DNA序列的結合位點。
[0059]將上述所構建的sgRNA靶序列載體及改造前、改造后的Cas9質粒載體用Pmel酶線 性化后膠回收，體外轉錄合成RNA。
[0060] 所述的s gRNA表達載體，含有一個T7啟動子控制s gRNA的表達，在用Bb s I限制酶切 消化后可插入20bp sgRNA的特異靶序列，該特異靶序列的識別位點位于PINK1基因第二外 顯子，Parkin基因第二外顯子，ASPM基因第三外顯子和第十外顯子。為了篩選能夠進行基因 編輯且脫靶效應較小的PINK1和ASPM基因的sgRNA序列，申請人利用NCBI的Blast軟件在獼 猴的PINK1基因和食蟹猴的ASPM基因序列上分別篩選了脫靶效應低且符合CRISPR/Cas9結 合基因組特征(5'-6(19~)-如63'）或者(5'-〇^(19~)-(：-3'）的靶序列位點，如表1，構建方 法參考已有文獻(Chang et al. ,2013)。
[0061 ] 實施例3
[0062] 構建的Ub-i_Cas9(i代表L P，R)質粒半衰期檢測。
[0063] 首先，將WT-Cas9和Ub-i-Cas9質粒轉染至293細胞，轉染48小時后，Western blot 檢測 Cas9 蛋白表達量結果顯示，以 WT-Cas9 為100 % 計，Ub-L-Cas9、Ub-P-Cas9、Ub-R-Cas9 分 別降解至84 · 76 %、80 · 92 % 和63 · 89 %。
[0064] 尤其是其中的Ub-R_Cas9,其序列上與Ub-L-Cas9、Ub-P_Cas9相交雖然只有一個堿 基的差別，然而驚奇的發現是其降解速率顯著地快于其他融合蛋白，達到了非常難得的程 度。
[0065] 隨后，我們比較了WT_Cas9和Ub-R_Cas9的半衰期，即在質粒轉染24小時后，添加50 微摩爾放線菌酮至培養基中，分別在〇h，2h，4h，8h，12h，24h收集細胞，Western blot檢測結 果如圖3B，C所示，與WT-Cas9相比，Ub-R-Cas9蛋白半衰期顯著縮短，在4小時便降解了約百 分之五十。
[0066] 其次，將WT_Cas9和Ubquitin-R_Cas9體外轉錄合成mRNA顯微注射于食蟹猴胚胎， 如表2所示，免疫組化結果顯示Ubquitin-R_Cas9在食蟹猴胚胎中比WT_Cas9降解速度明顯 加快。Ub-R-Cas9在注射48小時后的胚胎中含量比WT-Cas9少了69.18%。
[0067] 表2.Ubquitin-R-Cas9與WT-Cas9在胚胎中的Cas9殘留量比較
[0068] Luuov」 頭她例4
[0070] 所述成功構建的Ub-R-Cas9基因打靶功能及效率檢測。
[0071] 首先，將 WT-Cas9/Pink2-2sgRNA 和 Ub-R-Cas9/Pink2-2sgRNA 質粒分別轉染至 293 細胞，48小時后通過逐級稀釋方法挑選單個細胞或者多個細胞進行PCR鑒定，經T7E1檢測及 測序確認Ub-R-Cas9具有正常基因打靶功能，如圖4b。
[0072] 其次，將WT-Cas9或者Ub-R_Cas9mRNA與sgRNA共顯微注射入猴單細胞胚胎。待胚胎 發育至四細胞或八細胞時期分出單卵裂球進行單細胞PCR鑒定(PCR擴增引物序列見表3)。 此外，可利用胚胎單卵裂球分離方式將注射有WT_Cas9和Ub-R_Cas9的四細胞胚胎分離而來 的單卵裂球再次培養發育為四細胞時進行單細胞PCR，鑒定結果如圖6。
[0073] 表3.擴增引物序列
[0074]
[0075] 結果表明：該改造后的Ub-R-Cas9載體能夠對PINK1，Parkin和ASPM基因進行基因 打靶，打靶率高達73.83%。且1^-1?-0 &89與訂-0&89(8.25%)相比能夠明顯提高純合基因敲 除的概率高達28.97%，提高了約3.5倍，如圖5。此外，圖6結果也進一步證明Ub-R-Cas9因 具有快速降解能力從而保證四細胞胚胎后期的基因修飾類型的同一性，明顯降低了 WT-Cas9因半衰期較長而導致的持續打靶所引起的嵌合效應。
[0076] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均未脫離本發明的內容，都包含在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種Cas9融合蛋白，其特征在于包括Cas9片段及Ubquitin片段。2. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的Ubiquitin為Ubiquitin-L、 1]1^911；[1:;[11-?或1]131911；[1:;[11-1?;更優選地，所述的1]131911；[1:;[11為1]131911；[1:;[11-1?。3. 如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于含有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。4. 一種Cas9融合蛋白編碼序列，其特征在于含有Cas9DNA片段及Ubquitin DNA片段。5. 如權利要求4所述的編碼序列，其特征在于所述的Ubiquitin為Ubiquitin-L、 1]1^911；[1:;[11-?或1]131911；[1:;[11-1?;更優選地，所述的1]131911；[1:;[11為1]131911；[1:;[11-1?。6. 如權利要求4所述的編碼序列，其特征在于含有如SEQ ID NO.2所示DNA序列。7. -種含如權利要求4-6任一所述序列的質粒。8. -種含如權利要求4-6任一所述序列的表達載體。9. 一種基因打靶方法，其特征在于利用如權利要求1-3任一所述融合蛋白或權利要求 4-6任一所述編碼序列進行基因打靶;優選地，所述基因為哺乳動物基因；更優選地，所述基 因為非人類哺乳動物基因；進一步優選地，所述基因為非人類靈長類動物基因。10. -種降低動物細胞基因打靶嵌合效應的方法，其特征在于利用如權利要求1-3任一 所述融合蛋白或權利要求4-6任一所述編碼序列進行基因打靶;優選地，所述的細胞為哺乳 動物細胞;更優選地，所述的細胞為非人類哺乳動物細胞;進一步優選地，所述的細胞為非 人類靈長類動物細胞。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，涉及一種融合蛋白及編碼融合蛋白的DNA序列。具體地，本發明提供了一種包括Cas9片段及Ubiquitin片段的Cas9融合蛋白及其編碼序列。本發明一方面可以使得Cas9蛋白在胚胎細胞中發揮打靶作用之后迅速降解，從而降低了胚胎發育的嵌合突變效應。更重要的是，本發明所提供的Ubiquitin-i-Cas9(i為連接Ubiquitin和Cas9的連接子的首位氨基酸，其可以為精氨酸(R)或脯氨酸(P)或亮氨酸(L))蛋白可以提高基因打靶胚胎的純合效率。尤其是特別優選的Ubiquitin-R-Cas9蛋白，其對野生型Cas9蛋白基因打靶效率提高了3.51倍。這是技術人員預期之外的。
【IPC分類】C12N15/62, C12N9/22, C12N15/85, C07K19/00
【公開號】CN105647885
【申請號】
【發明人】李曉江, 涂著池, 楊偉莉, 郭祥玉, 李世華
【申請人】廣州元曦生物科技有限公司, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月20日