一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種羊凝乳酶的表達方法技術領域，尤其是涉及一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法。
【背景技術】
[0002]凝乳酶是一種從未斷奶的小牛皺胃中發現的天門冬氨酸蛋白酶，可以專一地切割乳中K-酪蛋白的Phe 105-Metl 06之間的肽鍵，破壞乳中的酪蛋白膠束引起蛋白質凝聚，因此在乳制品尤其是在干酪加工制作中應用廣泛。目前，凝乳酶的年均需求量約占全世界酶制劑總量的15%，居第二位。凝乳酶主要為動物來源的凝乳酶，約占市場上凝乳酶總量的70%，同時還有植物來源的凝乳酶、微生物來源的凝乳酶和利用基因工程技術生產的重組凝乳酶。
[0003]動物凝乳酶，除來源于小牛外，研究者還在乳豬、羔羊、小狗、海豹、駱駝、鱉魚、金槍魚等胃中提取出了凝乳酶。劉文宗等發現乳豬胃酶具有凝乳性;張富新等通過實驗證實羔羊皺胃酶也有較低的凝乳性。植物凝乳酶，無論從植物種類(木瓜、無花果、波蘿、南瓜、朝鮮薊、大豆、銀杏、合歡樹、甘薯和生姜等)還是植物組織的部位(果實、葉、莖和根等)，植物凝乳酶來源都十分廣泛。許多植物蛋白酶能使牛乳凝固，張富新等利用木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶與小牛皺胃酶和羔羊皺胃酶制得了較理想的干酪。微生物凝乳酶的研究始于自20世紀50年代末，主要在美國、日本、西德、丹麥等國進行，所用菌種主要有栗疫菌、毛霉、微小毛霉和錯狀芽胞桿菌等；自1964年Arima發現MucorpusiIIus可產生高活力凝乳酶以來，已有許多科學家發現產凝乳酶的新菌種，到目前為止，發現的產凝乳酶微生物達40余種。基因工程凝乳酶即將凝乳酶基因連接到合適載體并轉入宿主中所表達產生的酶。目前最常用的宿主是大腸桿菌(Esherichiacoli)，但是表達的凝乳酶主要以包涵體的形式，需要復性，因此增加了成本。Stefan利用在黑曲霉中表達，發酵產生單駝峰凝乳酶，經過與小牛凝乳酶比較發現，重組單駝峰凝乳酶的凝結能力高于小牛凝乳酶70%，且有更高的的耐熱穩定性。之后Bansa利用這一結論使用重組單駝峰凝乳酶加工Cheddar干酪，根據干酪特性與傳統方法進行比較，顯示出并無明顯差異。此外，絲狀真菌、微小毛霉、米黑根毛霉、構巢曲霉都適用于轉入凝乳酶基因。
[0004]傳統的凝乳酶來源于小牛皺胃.但是隨著世界奶酪產業的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現代工業的發展不相符，植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強，并且受時間、地點等的限制難以發展。微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶生產干酪以來，成功地彌補了小牛凝乳酶短缺的問題，并在奶酪制造業與酪素產業中得到了廣泛的應用。微生物蛋白酶存在著專一性不強、凝乳活性和分解活性比值低、對熱穩定、乳中殘留量高等問題，常常引起干酪產量降低，風味不佳，而利用基因工程技術生產凝乳酶可以避免上述缺陷。利用植物體(或細胞、組織、器官)所具有的生物功能在體外或體內進行生化反應，而獲取特定產品的轉化系統，稱為植物生物反應器，通常是指完整的轉基因植物體。
[0005]利用轉基因植物作為生物反應器生產的酶是一種新興的技術，具有巨大潛力。相比傳統的發酵方法，利用轉基因植物生產酶的工業規模的成本通常低得多，也消耗更少的能量。近年來，植物表達系統作為極具潛力的重組蛋白生產平臺，備受各國科學家的關注，得到了廣泛和深入的研究。
[0006]利用植物作為生物反應器生產重組蛋白有很多優點:(I)生產的重組蛋白可進行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產物具有相同或相似的結構和生物學功能；(2)具有本質的安全性，不會傳播動物病毒或是感染病原菌；(3)是符合成本效益的生物工藝，生產成本和下游純化成本都較低，生產使停工的風險最小化。直接使用表達重組蛋白如藥物蛋白或疫苗的植株或植物部分組織(如種子或果實)可以進一步減少生產成本，值得探索和研究。
[0007]利用轉基因技術構建植物生物反應器平臺生產重組凝乳酶也有研究報道。如有研究者在轉基因煙草和馬鈴薯葉片中表達凝乳酶基因，但只獲得了葉片總蛋白的0.1%-
0.5%的凝乳酶蛋白。Rooijen等在植物種子中重組表達牛凝乳酶基因，并提出了從種子中分離提純酶蛋白的方法，凝乳酶的積累量至少占種子中總蛋白的0.5%。因此，從植物體內獲得具有活性的，高產量的凝乳酶，仍需進一步研究。
【發明內容】
[0008]本發明所要解決的技術問題就是提供一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，通過將羊凝乳酶基因進行了克隆然后轉入玉米基因組中，在玉米籽粒中過量表達，以期在玉米籽粒中得到具有凝乳活性的羊凝乳酶可溶性的融合蛋白，為進一步實現凝乳酶制劑的微生物發酵生產奠定基礎。
[0009]為實現上述目的，本發明采用下述技術方案:
[0010]一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，包括以下步驟:
[0011]A.玉米籽粒特異性表達載體構建
[0012]通過PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動子Glzml(GenBank:L22344.1)，在啟動子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點，亞克隆到植物表達載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動子；
[0013]在羊凝乳酶基因(GenBank:AY389343.1)編碼氨基酸的N端添加6個組氨酸，根據玉米密碼子偏好性對進行密碼子優化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點，序列設計好后進行合成;合成后的序列替換植物表達載體上的GUS基因，最終成功構建玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymos in ；
[0014]B.玉米遺傳轉化與PCR鑒定
[0015]凍融法將構建好的玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymosin導入農桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進行農桿菌介導的遺傳轉化，并用3mg/L的雙丙氨膦進行篩選，在啟動子6121111上設計引物6121111?(5’60404461'了406401^1'11'3’)，在目的基因prochymosin上設計引物chyR(5 ’CTGCTGGATGTTGAGGAT3 ’)，對所獲得的抗性植株進行PCR檢測，所獲得的陽性植株在溫室中繼續培養，自花授粉，收取種子；
[0016]C.轉基因植株的southern雜交分析
[0017]CTAB法提取不同轉化事件Tl代植株總DNA，經BamHI和HindII I (英國NEB公司)酶切，0.8 %瓊脂凝膠30V電泳8個小時后轉移到硝酸纖維素膜上，紫外交聯兩次，每次30秒，間隔2分鐘，以地高辛標記的GlzmlF和chyR的PCR產物為探針，TRANS15K DNA marker(中國全式金生物技術有限公司，北京)為標準分子量，按照DIG High Prime DNA Labeling andDetect1n Starter Kit I(瑞士Roche公司)試劑盒提供的方法進行Southern blot分析。
[0018]D.轉基因植株的western雜交分析
[0019]玉米籽粒經烘干后研磨成粉末，按照1: 2的比例加入PBS緩沖液(137mM NaCl，2.7mM KCiaOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)，冰上撫育5分鐘，期間每隔30秒振蕩混勻一次。12000g離心5分鐘，取1uL上清液加入等體積的2 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5分鐘，經12 % SDS-PAGE電泳后，用半干轉膜儀(200mA，30min，B1-Rad，USA)轉至尼龍膜上，經5 % BSA(w/v)的TBS-Tween封閉后，以羊凝乳酶免疫小鼠制備的單克隆抗體為一抗(1:5000)，商業化的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體為二抗(1: 3000，ant 1-mouse IgG alkalinephosphatase con jugate，Novagen)進行western雜交檢測不同轉化事件中羊凝乳酶的表達水平。
[0020]E.蛋白純化與活性分析
[0021 ] 提取玉米軒粒的可溶性總蛋白，并用His PurN1-NTA Resin and Kits(Thermo)純化帶his標簽的羊凝乳酶。用SDS-page分析純化情況。
[0022]將直接提取自玉米籽粒的可溶性總蛋白和經純化后的羊凝乳酶用HCl條件PH值至2.0，室溫孵育2小時后，再用IM的Tr is緩沖液(pH8.0)調節蛋白溶液PH值至6.3 ,western檢測活化情況。
[0023]凝乳酶酶活測定方法:采用Arima K的方法進行凝乳酶活性的測定。用0.0lmol/LCaCl2溶液配制10%脫脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10%脫脂乳于35°C保溫lOmin，加入適量稀釋的酶制劑，振蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現凝乳顆粒為終點，記錄凝乳時間(t)。在上述條件下，40min凝結lmL10%脫脂乳的酶量定義為一個Soxhlet單位(SU) ο
[0024]凝乳酶活力=(實驗用乳量/凝乳酶量)X(40/t)。
[0025]與現有技術相比，本發明的有益效果為:(I)生產的重組蛋白可進行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產物具有相同或相似的結構和生物學功能；(2)具有本質的安全性，不會傳播動物病毒或是感染病原菌；(3)是符合成本效益的生物工藝，生產成本和下游純化成本都較低，生產使停工的風險最小化。
【附圖說明】
[0026]圖1是玉米籽粒特異性表達載體pC330_Gprochymosin結構示意圖。
[0027]圖2是玉米轉基因植株的獲得示意圖。
[0028]圖3是玉米轉基因植株的southern雜交圖。
[0029]圖4是玉米轉基因植株的western雜交圖之一。
[0030]圖5SDS-page檢測結果。
[0031 ] 圖6是玉米轉基因植株的western雜交圖之二。
[0032]圖7是羊凝乳酶活性檢測圖。
【具體