銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac11的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，具體涉及銅綠假單胞菌(PA)重組蛋白Vacll(AmpDh3) 的分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界、 正常人皮膚、腸道、呼吸道中，感染可發生在人體任何部位和組織，該菌目前已成為ICU病 房、燒傷、戰創傷等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20 %以上。
[0003]目前在PA疫苗方面已開展了廣泛研究，但普遍存在抗原類型單一、免疫保護效果 低下等問題，尚無一種疫苗進入臨床應用。AmpDh3是銅綠假單胞菌的典型鋅蛋白酶，其位于 細菌的周衆間隙，在細菌細胞壁的形成和重構(re-modeling)過程中發揮重要作用(Lee Μ 等，J Am Chem Soc.2013)。此外，AmpDh3基因的缺失會導致銅綠假單胞菌細菌的毒力明顯 下降（Moya B,等Antimicrob Agents Chemother. 2008)。鑒于AmpDh3在銅綠假單胞菌生理 和致病過程中的重要作用，其可以作為重組基因工程亞單位疫苗的重要候選抗原。
[0004] 申請人采用基因工程技術克隆通過大腸桿菌基因工程菌表達獲得銅綠假單胞菌 (PA)疫苗重組蛋白Vacll(AmpDh3)，所述重組蛋白經動物試驗證明，可有效刺激機體產生較 高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用，有利于銅綠假單胞菌的預防、診和治療。目前， 尚未見針對該重組蛋白Vac 11的純化方法的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的：提供一種銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白Vacll疫苗 的純化方法。該方法工藝簡單，所獲得目標蛋白純度高，容易放大、重復性好，回收率較好。
[0006] 本發明的技術方案是：
[0007] 銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vacll，其核酸序列如SEQ ID NO:1所不、氣基酸序列如SEQ ID NO:2所不。
[0008] 銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗候選抗原Vacll的純化方法。包括步驟:收 集制備的所述抗原Vacl 1;按照高壓破菌、離心;GST親和純化;Q HP層析純化;Q HP層析純 化;G 25層析純化;Q HP層析純化的順序組合對制備的抗原進行純化。
[0009] 上述純化方法的具體步驟如下：
[0010] 1)高壓破菌
[0011]收集的菌體用pH為7.0-7.5的1 OmM PB緩沖液混勻懸浮，預冷后采用高壓勻漿破 菌，高速離心，收集上清；
[0012] 2)GST親和純化
[0013] GST親和層析填料進行初步純化，使用A液對目標蛋白進行純化，Prescission Protease酶進行酶切洗脫：
[0014] 3)Q HP層析純化
[0015] 將經步驟2)純化的目標蛋白，使用A平衡層析系統及Q HP層析柱，B液線性梯度洗 脫；
[0016] 4)G 25層析純化
[0017]將經步驟3)純化的目標蛋白，使用G25層析柱純化，采用C液平衡層析系統及層析 柱，分離純化目標蛋白，置換緩沖液；
[0018] 5)Q HP層析純化
[0019] 將經步驟4)純化的目標蛋白，加入0.1%Triton X-100混勻，采用D液平衡層析系 統及Q HP層析柱，去除痕量非目標蛋白，內毒素等雜質，分離純化目標蛋白；
[0020] 其中，A液為PH7.0-7.5的20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4的緩沖溶液，B液為PH7.0-7.5的 20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，lM NaCl，C液為ρΗ6·0的 10mM His，0.25M NaCl，D液為ρΗ6·0的 10mM His，0.25M NaCl，0.1%Triton X-100。
[0021] 步驟1)所述的高壓勻漿破菌采用60_80MPa，高速離心獲取破菌上清。
[0022] 步驟2)所述的GST親和層析使用的填料為Glutathione Sepharose 4B或 Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP〇
[0023] 步驟2)所述的Prescission Protease酶帶有GST標簽。
[0024] 步驟3)所述的Q HP層析柱的填料為Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇
[0025] 步驟4)所述的G 25層析柱為Sephadex G_25Coarse或Sephadex G_25Medium或 Sephadex G_25Fine或Sephadex G_25Superfine〇
[0026] 步驟5)所述的Q HP層析柱為Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇
[0027] 上述純化方法所述抗原Vacll，采用以下方法制備：
[0028] 1)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成獲得銅綠假單胞菌亞單位 重組基因工程疫苗候原Vacll蛋白片段的核苷酸序列；
[0029] 2)將步驟1)獲得的核苷酸序列克隆表達至表達載體構建重組載體，然后將該重組 載體轉化至宿主菌；
[0030] 3)誘導轉換后的宿主菌表達重組蛋白。
[0031]發明效果
[0032]采用本發明所述的純化方法，從表達銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白 Vacll的大腸桿菌工程菌中可以獲得純度大于98%，回收率大于45%的目的蛋白，通過氨基 酸序列預測本發明人構建獲得的蛋白Vacl4分子質量約為28.7kD，等電點在pH 6.1左右。 [0033] 本發明所述的純化方法主要有GST親和純化、Q HP層析、G25層析、Q HP層析，通過 上述方法純化的蛋白用12% SDS-PAGE檢測，呈現出單一目標蛋白條帶，分子質量約為 291Λ&(3ΗΡΙΧ C3柱分析目的蛋白純度為97.6 %。純化后的Vacl 1與氫氧化鋁佐劑共同注射免 疫BalB/C小鼠，結果發現Vacll加免疫佐劑組血清中的IgG水平顯著高于陰性對照組(PBS 組）(P〈〇.01)，證明使用本發明人純化方法獲得的抗原Vacll可有效刺激機體產生較高的免 疫應答。使用臨床株XN-1(CCTCC Μ 2015730)感染，發現Vacll加免疫佐劑組感染率為30%， 對照組(PBS組)感染率為80%，計算得出Vacll抗PA感染的保護率為62.5%。
【附圖說明】
[0034] 圖1為Vacll基因片段的PCR擴增結果，其中泳道1:核酸（DNA)分子量標準 (Marker)，從上到下大小分別為:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp ;;泳道2&3:目的基 因片段 Vacll(~750bp);
[0035] 圖2為重組質粒pGex-6P-2_Vacl 1的雙酶切鑒定結果，其中，泳道1:核酸(DNA)分子 量標準(Marker)，從上到下大小分別為：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2:重 組表達質粒pGEX-6p-2-Vacll經酶切后的鑒定結果，酶切后分離的片段約4000bp和約 750bp；
[0036] 圖3為蛋白Vacll誘導鑒定結果，其中，泳道1:蛋白分子量標準(Marker)，從上到下 大小分別為：170Kd、130Kd、1 OOKd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、1 OKd;泳道 2:結合誘 導表達的超聲上清的GST填料;泳道3~5:經PP酶酶切后的上清;泳道6:經PP酶酶切后的GST 填料；
[0037]圖4為純化后的蛋白Vac 11SDS-PAGE電泳結果，其中，泳道1 :蛋白分子量標準 (Marker)，從上到下大小分別為：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、 10Kd;泳道2:純化的Vacll蛋白；
[0038]圖5為Q HP層析圖；
[0039] 圖6為G 25層析圖；
[0040]圖7為Q HP層析圖；
[0041 ] 圖8為GST親和PP酶酶切、Q HP層析后SDS-PAGE結果，圖中，泳道1:蛋白分子量 marker;泳道2:目的蛋白與GST填料結合后；泳道3: PP酶酶切后洗脫樣品；泳道4: PP酶酶切 后的GST填料;泳道5:Q HP層析洗脫樣品Peakl;
[0042]圖9為Q HP層析去內毒素后SDS-PAGE結果，圖中，泳道Μ:蛋白分子量marker;泳道 1:Q HP層析去內毒素流穿樣品；
[0043]圖10為最終樣品的HPLC純度檢測圖。
【具體實施方式】
[0044] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進一步詳細說明。應當理解，此處說描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0045] 菌株與各種試劑如下：
[0046] 1.銅綠假單胞菌菌株
[0047] 銅綠假單胞菌國際標準株PA01由美國ATCC提供（ATCC?BAA-47?);
[0048] 2.試劑
[0049] 質粒pGEX_6p_2購自GE Healthcare Life Sciences公司，申請人保存；
[0050] 大腸桿菌菌株XL-lblue購自上海超研生物科技有限公司，申請人保存；
[0051 ] primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性內切酶BamH I和EcoR I、蛋 白Marker為大連TakaRa公司產品；
[0052]質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產品。
[0053] Na2HP〇4.12H20、NaH2P〇4.2H20、NaCl、NaOH、吐溫 20、硫酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉均購 自國藥集團化學試劑有限公司；
[0054] PBS購自北京中杉金橋生物技術有限公司；
[0055] Tryptone、Yeast extract均購自英國0X0ID公司；
[0056 ] Amp icilline、氯化鈉注射液購自太極集團西南藥業；
[0057] IPTG、L-組氨酸、Triton x-100購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0058]蛋白上樣緩沖液購于碧云天生物技術；
[0059]蛋白Marker購于 Thermo公司；
[0060] TFA、乙腈購自TEDIA公司；
[0061 ] A1(0H)3 購自 Brenn