實施方式】
[0033]為使對本發明的結構特征及所達成的功效有更進一步的了解與認識，用以較佳的實施例及附圖配合詳細的說明，說明如下:
[0034]一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，包括以下步驟:
[0035]A.玉米籽粒特異性表達載體構建
[0036]通過PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動子Glzml (GenBank: L22344.1)，在啟動子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點，亞克隆到植物表達載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動子；
[0037]在羊凝乳酶基因(GenBank:AY389343.1)編碼氨基酸的N端添加6個組氨酸，根據玉米密碼子偏好性對進行密碼子優化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點，序列設計好后進行合成;合成后的序列替換植物表達載體上的GUS基因，最終成功構建玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymos in ；
[0038]B.玉米遺傳轉化與PCR鑒定
[0039]凍融法將構建好的玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymosin導入農桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進行農桿菌介導的遺傳轉化，并用3mg/L的雙丙氨膦進行篩選，在啟動子6121111上設計引物6121111?(5’60404461'了406401^1'11'3’)，在目的基因prochymosin上設計引物chyR(5 ’CTGCTGGATGTTGAGGAT3 ’)，對所獲得的抗性植株進行PCR檢測，所獲得的陽性植株在溫室中繼續培養，自花授粉，收取種子；
[0040]C.轉基因植株的southern雜交分析
[0041 ] CTAB法提取不同轉化事件Tl代植株總DNA，經BamHI和HindII I (英國NEB公司)酶切，0.8 %瓊脂凝膠30V電泳8個小時后轉移到硝酸纖維素膜上，紫外交聯兩次，每次30秒，間隔2分鐘，以地高辛標記的GlzmlF和chyR的PCR產物為探針，TRANS15K marker(中國全式金生物技術有限公司，北京)為標準分子量，按照DIG High Prime DNA Labeling andDetect1n Starter Kit I(瑞士Roche公司)試劑盒提供的方法進行Southern blot分析。
[0042]D.轉基因植株的western雜交分析
[0043]玉米籽粒經烘干后研磨成粉末，按照1: 2的比例加入PBS緩沖液(137mM NaCl，2.7mM KCiaOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)，冰上撫育5分鐘，期間每隔30秒振蕩混勻一次。12000g離心5分鐘，取1uL上清液加入等體積的2 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5分鐘，經12 % SDS-PAGE電泳后，用半干轉膜儀(200mA，30min，B1-Rad，USA)轉至尼龍膜上，經5 % BSA(w/v)的TBS-Tween封閉后，以羊凝乳酶免疫小鼠制備的單克隆抗體為一抗(1:5000)，商業化的堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體為二抗(1: 3000，ant 1-mouse IgG alkalinephosphatase con jugate，Novagen)進行western雜交檢測不同轉化事件中羊凝乳酶的表達水平。
[0044]E.蛋白純化與活性分析
[0045]提取玉米軒粒的可溶性總蛋白，并用His Pur N1-NTA Resin and Kits(Thermo)純化帶his標簽的羊凝乳酶。用SDS-page分析純化情況。
[0046]將直接提取自玉米籽粒的可溶性總蛋白和經純化后的羊凝乳酶用HCl條件PH值至2.0，室溫孵育2小時后，再用IM的Tr is緩沖液(pH8.0)調節蛋白溶液PH值至6.3 ,western檢測活化情況。
[0047]凝乳酶酶活測定方法:采用Arima K的方法進行凝乳酶活性的測定。用0.0lmol/LCaCl2溶液配制10 %脫脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10 %脫脂乳于35°C保溫lOmin，加入適量稀釋的酶制劑，振蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現凝乳顆粒為終點，記錄凝乳時間(t)。在上述條件下，40min凝結lmL10%脫脂乳的酶量定義為一個Soxhlet單位(SU)。
[0048]凝乳酶活力=(實驗用乳量/凝乳酶量)X(40/t)。
[0049]結果與分析
[°°50] 1.玉米轉基因植株的獲得及southern雜交檢測
[0051 ]玉米幼胚經侵染后，共培養3天，在抑菌培養基上暗培養7天，隨后轉到含有3mg/L雙丙氨膦的選著培養基上上篩選，約6周后出現抗性愈傷組織，將其轉入分化培養基I兩周后，再轉入分化培養基Π繼續分化，共計獲得抗性再生植株31株。(如圖2所示:A，農桿菌侵染玉米幼胚;B，愈傷組織篩選;C，抗性植株再生;D，生根培養;E，轉基因植株結實;F，轉基因玉米籽粒)經PCR檢測，共檢測出7株陽性植株。對其進行southern雜交分析，結果表明其中共含有3株單拷貝轉基因植株(如圖3所示:M，transl5k DNA Marker ; +，質粒pC330_Gprochymosin;-，野生型植株;1-7，不同轉基因植株品系)。
[0052]2.玉米轉基因植株的western雜交檢測
[0053]Western雜交結果表明(如圖4所示，M，蛋白分子量;wt，野生型植株；1-3，不同轉基因植株品系)，野生型玉米籽粒中沒有目的條帶，而3株單拷貝轉基因植株籽粒中均含有大小約為40KDa的羊凝乳酶，其中第一條泳道內的玉米轉化事件的籽粒總蛋白中重組羊凝乳酶原的表達量明顯高于其他兩株。對其進行Elisa定量檢測結果發現羊凝乳酶約占總可溶性蛋白的0.27 %。
[0054]3.蛋白純化與活性分析
[0055]SDS-page檢測結果(圖5:M，蛋白分子量；I，轉基因植株籽粒總蛋白(上樣液)；2，流出液;3，洗滌液;4，純化的羊凝乳酶原)表明，玉米籽粒中的總蛋白經鎳柱純化試劑盒進行純化后僅在42kDa處出現一條清晰的條帶，Elisa鑒定純化后的羊凝乳酶酶原占總蛋白的83%以上。Western結果(圖6:M，蛋白分子量;-，野生型植株；I，轉基因植株籽粒總蛋白；2，活化處理的轉基因植株籽粒總蛋白；3，純化的羊凝乳酶原；4，活化處理的羊凝乳酶原)表明，無論是轉基因植株總蛋白還是經純化后的羊凝乳酶酶原在PH值2.0條件下室溫處理2h，均可將幾乎所有的羊凝乳酶由42kDa的酶原變為36kDa，完成活化。將活化后的轉基因玉米籽粒總蛋白和重組羊凝乳酶純品進行凝乳實驗，證實他們均具有凝乳活性(圖7: +，商業化凝乳酶;_，PBS緩沖液;wt，野生型植株；I，轉基因植株籽粒總蛋白；2，活化處理的轉基因植株籽粒總蛋白；3，純化的羊凝乳酶原;4，活化處理的羊凝乳酶原)ο按照ArimaK的方法進行計算，純化后的重組羊凝乳酶活力可達到178.5U/mg。
[0056]以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。
[0057]本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明的范圍內。本發明要求的保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
【主權項】
1.一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，其特征在于:包括以下步驟:通過PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動子Glzml，在啟動子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點，亞克隆到植物表達載體PCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動子； 在羊凝乳酶基因編碼氨基酸的N端添加6個組氨酸，根據玉米密碼子偏好性對進行密碼子優化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點，序列設計好后進行合成;合成后的序列替換植物表達載體上的GUS基因，最終成功構建玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymosin02.根據權利要求1所述的轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，其特征在于:凍融法將構建好的玉米籽粒特異性表達載體pC330_Gprochymosin導入農桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進行農桿菌介導的遺傳轉化，并用3mg/L的雙丙氨膦進行篩選，在啟動子GIzmI上設計引物GlzmlF，在目的基因prochymosiη上設計引物chyR，對所獲得的抗性植株進行PCR檢測，所獲得的陽性植株在溫室中繼續培養，自花授粉，收取種子。
【專利摘要】本發明公開了一種轉基因玉米種子中羊凝乳酶的表達方法，包括以下步驟：通過PCR法克隆玉米globulin-1基因的啟動子Glzm1，在啟動子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點，亞克隆到植物表達載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動子；在羊凝乳酶基因編碼氨基酸的N端添加6個組氨酸，根據玉米密碼子偏好性對進行密碼子優化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點，序列設計好后進行合成；合成后的序列替換植物表達載體上的GUS基因，最終成功構建玉米籽粒特異性表達載體pC330-Gprochymosin。本發明的有益效果為：(1)生產的重組蛋白可進行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產物具有相同或相似的結構和生物學功能；(2)具有本質的安全性，不會傳播動物病毒或是感染病原菌。
【IPC分類】A01H5/10, C12N9/64, C12N15/82
【公開號】CN105647895
【申請號】
【發明人】劉文國, 王云鵬, 路明, 張志軍, 王敏, 呂慶雪, 趙萬慶, 岳堯海, 劉宏偉, 張建新, 馬英杰, 周旭東, 孟令聰, 李巖
【申請人】吉林省農業科學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月12日