(LD比值）的大小選擇高活力菌株。選取LD比值大的菌落移接到 PDA試管斜面上培養保存備用(見圖1)。
[0043] 原生質體制備：
[0044]將PDA試管斜面保藏的匍枝根霉菌株的孢子用生理鹽水洗脫，混勻后稀釋至IX 105個/mL;將上述孢子懸液轉接于含有100mL PDA培養基的500mL三角燒瓶中，調整孢子濃 度為1〇7個/mL，于轉速為150r/min的搖床上培養12h;將所得培養物于3500r/min離心，取沉 淀，并用生理鹽水洗滌兩次、離心，再用〇.6mol/L KC1高滲溶液洗滌一次離心取沉淀；
[0045] 利用電子天平準確稱取2g經處理后的菌絲體，加入20mL 3mg/mL破壁液，破壁液的 成分為蝸牛酶:纖維素酶=3:1，充分混勻，于30°C，160rpm震蕩孵育，并每隔0.5h鏡檢一次 觀察原生質體的生成情況計數，確定酶解時間，用四層無菌顯微鏡紙將原生質體液過濾，去 除菌絲片段取濾液，3500r/min離心10min，收集原生質體，用有機糖醇滲透壓穩定劑洗2次， 得到純化的原生質體。
[0046] 誘變選育：
[0047] 取5mL上述純化的原生質體于無菌的9cm培養皿中，用15W紫外燈距離30cm處照射 進行誘變，紫外燈事先預熱30min以使得紫外光照穩定，取不同照射時間的處理液，涂布于 高滲初篩培養基平板上，高滲初篩培養基平板的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 5-10g;葡 萄糖3-5g;瓊脂10-20g;MandelS無機營養鹽1000mL;KCl 0.6mol;黑暗避光30°C恒溫培養， 待平板長出菌落后，轉接PDA斜面培養；
[0048] 利用CMC-剛果紅平板法，初步篩選出透明圈與菌落直徑較大的菌株，通過搖瓶發 酵復篩的方法選出高活性纖維素酶的突變株。
[0049] 復篩：
[0050] 將PDA斜面培養物用生理鹽水洗下，充分混勻適當稀釋至IX 105個/mL，制備成孢 子懸液;將孢子懸液接種于內含50mL液態種子培養基的250mL三角瓶中，液態種子培養基的 成分為10%麩皮浸出汁(稱取l〇〇g麩皮，加入800mL蒸餾水煮沸30min，4層紗布過濾，定容至 1000mL)，調整孢子濃度為10 7個/mL，于轉速為150r/min的搖床上培養12h，得到種子培養 液；
[0051 ] 于500mL三角瓶內添加約200mL的液態發酵培養基，接入20mL種子培養液，30°C， 180rpm振蕩培養12h。所述液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有:80~120目的玉米猜 桿、稻草或麥桿5-10g，5%麩皮浸出汁8〇-100g，（NH4)2S〇4 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4 · 7H20 5-10g，CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素：FeS〇4*7H20 0.003-0.005g， MnS04*H20 0.001-0.00156g,ZnS04 · 7H20 0.001-0.0014g,C0CI2 · 6H20 0.001-0.002g,pH 5.0〇
[0052]通過對發酵產物酶解還原糖產量的測定，篩選出酶活性高的菌株進入下一輪發酵 產酶條件的研究。
[0053]表1水解圈大小與酶活力高低的關系
[0054]
[0055]
[0056]對篩選出來的菌株TP-02進行連續傳代10代，通過液體發酵的方式，測定其酶活， 研究其遺傳穩定性如表1所示，由表1可知，突變株TP-02經傳 10代培養，任意2代間FPA和CMC 酶活力，差值均在10%內，表明該菌株產酶性能穩定，可作為后繼實驗出發菌株。
[0057] 表2突變株TP-02遺傳穩定性 rnnwi
[0059] 菌種鑒定：
[0060] 經PCR獲得該菌種的ITS-5.8S rDNA序列并經測序與NCBI上利用核苷酸比對。從 NCBI上獲得相關菌種的公認標準序列數據，用ClustalX 1.8進行多重分析比對。利用 MEGA3.1、PAUP軟件，以根霉屬的近緣屬種里氏木霉為外群，構建MP和ML系統發育樹。本研究 菌種與匍枝根霉點頭根霉序列同源率高達99.8%。一般認為同源率大于98%可以認為屬于 同一個種。因此根據分子學水平鑒定為根霉屬匍枝根霉亞種點頭根霉。結合形態學鑒定結 果，初步鑒定TP-02菌株為接合菌亞門、藻狀菌綱、毛霉目、毛霉科、根霉屬菌、匍枝根霉亞種 點頭根霉，其基因序列表如SEQUENCE LISTING 1所示。
[0061 ] 實施例2
[0062] -種產纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：
[0063] 其它同實施例1，只是其中的初篩培養基的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 5g;葡 萄糖3g;瓊脂10g; Mande 1S無機營養鹽1 OOOmL;
[0064] 高滲初篩培養基平板的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 5g;葡萄糖3g;瓊脂10g; Mande IS 無機營養鹽 1 OOOmL ;KC1 0.6mol;
[0065]液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有：80~120目的玉米猜桿5g，5%麩皮浸 出汁80g，（NH4)2S〇4 20g，KH2P〇4 5g，MgS〇4.7H20 5g，CaCl2 10g，Tween80 0.15g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.003g，MnS〇4· H20 0.001g，ZnS〇4· 7H20 0.001g，CoCl2· 6H20 0.001g，pH 5.0〇
[0066] 實施例3
[0067] -種產纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：
[0068]其它同實施例1，只是其中的初篩培養基的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 10g; 葡萄糖5g;瓊脂20g;MandelS無機營養鹽lOOOrnL;
[0069]高滲初篩培養基平板的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 10g;葡萄糖5g;瓊脂20g; Mande IS無機營養鹽 1000mL;KCl 0.6mo 1 ；
[0070]液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有:80~120目的稻草10g，5%麩皮浸出汁 100g，（NH4)2S〇4 30g，KH2P〇4 10g，MgS〇4.7H20 10g，CaCl2 20g，Tween80 0.25g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.005g，MnS〇4· H20 0.00156g，ZnS〇4· 7H20 0.0014g，CoCl2· 6H20 0.002g，pH 5.0〇
[0071] 實施例4
[0072] -種產纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：
[0073] 其它同實施例1，只是其中的初篩培養基的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 8g;葡 萄糖4g;瓊脂15g; Mande 1S無機營養鹽1 OOOmL;
[0074] 高滲初篩培養基平板的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 8g;葡萄糖4g;瓊脂15g; Mande IS 無機營養鹽 1 OOOmL ;KC1 0.6mol;
[0075]液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有：80~120目的麥桿8g，5%麩皮浸出汁 90g，（NH4)2S〇4 25g，KH2P〇4 8g，MgS〇4.7H20 8g，CaCl2 15g，Tween80 0.2g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.004g，MnS〇4· H20 0.0014g，ZnS〇4· 7H20 0.0012g，CoCl2 · 6H20 0.0015g，pH 5.0〇
[0076] 實施例5
[0077] -種維素酶的生產方法，所述方法包括以下步驟：
[0078]種子的制備方法同實施例2;
[0079]液態發酵生產纖維素酶：
[0080]吸取5mL種子培養液接入45mL液態發酵培養基，接種后發酵培養基裝基裝液量為 250mL三角瓶裝50mL培養基。接種后置于震蕩恒溫培養中培養，培養溫度為30°C，搖床轉速 為200rpm/min，總培養時間為4d，期間每12h從發酵液中吸取lmL液體并對其酶活力進行測 定。在發酵培養84h之后，發酵液中纖維素酶濾紙酶活(FPA)、內切酶酶活、外切酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶達到最大值，分別為13.16IU/mL，45.81IU/mL、0.537IU/mL，12.45IU/mL，如圖 2所示。
[0081]所述液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有:80~120目的麥桿5g，5%麩皮浸 出汁 100g，（NH4)2S〇4 26g，KH2P〇4 8g，MgS〇4.7H20 9g，CaCl2 18g，Tween80 0.2g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.004g，MnS〇4· H20 0.0015g，ZnS〇4· 7H20 0.0013g，CoCl2 · 6H20 0.0015g，pH 5.0〇
[0082] 實施例6
[0083] 一種維素酶的生產方法，所述方法