包括以下步驟：
[0084] 種子制備：
[0085]將菌株TP-02在PDA斜面培養基中培養3d后用無菌水洗下孢子，使用血球計數板計 算孢子數并稀釋至1 X 1〇5個/mL。按10 %接種量接入裝液量200mL (500mL三角瓶)液態種子 培養基中，于30°C、200rpm條件下培養24h后作為種子液備用，并將所得種子液保存在-80 °(：超低溫甘油凍結管中；
[0086]取-80 °C超低溫甘油凍結管置室溫溶解并劃線roA斜面培養基，于30 °C培養培養3d 后用無菌水洗下菌絲或孢子，每個平板使用5mL無菌水進行洗滌，吸取2mL洗滌后獲得的菌 絲懸液接入48mL液態種子培養基中，接種后種子培養基裝液量為250mL三角瓶裝50mL培養 基，于30°C，搖床轉速為200rpm，恒溫培養24h后，即為搖瓶發酵產酶的種子培養液。
[0087]液態發酵生產纖維素酶：
[0088]在3L發酵罐中裝2L液態發酵培養基，接入200mL種子培養液進行發酵。發酵條件： 培養溫度為30°C，攪拌轉速為450r/min，通氣量為4.5vvm，罐壓為0.03MPa，通過流加氨水控 制pH在5.0~5.5范圍內，具體?!1可以為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5這些數值。在上述培養條 件下，培養88h，期間每4h從發酵液中吸取lmL液體并對其酶活力進行測定。發現培養84h后， 濾紙酶活力達到16.98IU/mL，內切酶酶活達到41.33IU/mL，外切酶酶活達到3.65IU/M1，葡 聚糖苷酶酶活力達到15.98IU/mL，如圖3所示。
[0089]所述液態發酵培養基的成分為:每L培養基含有：80~120目的玉米秸桿8g，5%麩 皮浸出汁90g，（NH4)2S〇4 20g，KH2P〇4 5g，MgS〇4.7H20 7g，CaCl2 15g，Tween80 0.15g，微量 元素：FeS〇4 · 7H20 0.003g，MnS〇4 · H20 0.001g，ZnS〇4 · 7H20 0.001g，CoCl2 · 6H20 O.OOlg， pH 5.0〇
[0090] 實施例7
[0091] 纖維素酶的檢測方法
[0092] 濾紙酶活的測定:準確吸取適當稀釋10-50倍的酶液0.5mL，放入一條lcm X 6cm的 濾紙于pH 4.8的0.05mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液及0.5mL pH 4.8的0.05mol/L檸檬 酸一檸檬酸鈉緩沖溶液，于50°C保溫30min后加入3mL DNS試劑沸水浴lOmin，冷卻后加水稀 釋至25mL，測定520nm處吸光值。
[0093] β-葡萄糖苷酶:準確吸取適當稀釋10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL質量分數為1 % 水楊苷(溶于pH 4.8的0.05mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液)及0.5mL pH 4.8的0.05mol/ L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液，于50°C保溫30min后加入3mL DNS試劑沸水浴lOmin，冷卻后 加水稀釋至25mL，測定520nm處吸光值。
[0094]內切酶酶活測定：準確吸取適當稀釋10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL質量分數為 1%CMC(溶于pH 4.8的0.05mol/L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液)及0.5mL pH 4.8的0.05mol/ L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液，于50°C保溫30min后加入3mL DNS試劑沸水浴lOmin，冷卻后 加水稀釋至25mL，測定520nm處吸光值。
[0095] 外切酶酶活測定:確吸取適當稀釋10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL質量分數為2% 微晶纖維素酶(溶于口114.8的0.05111〇1/1檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液)及0.51^?!14.8的 0.05mo 1 /L檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖溶液，于50 °C保溫30miη后加入3mL DNS試劑沸水浴 lOmin，冷卻后加水稀釋至25mL，測定520 nm處吸光值。
[0096] 纖維素酶活力單位定義:在上述反應條件下，每分鐘水解生成Ιμπιο?葡萄糖所需的 酶量為1個酶活國際單位(IU)。
[0097] 上述參照實施例對產纖維素酶菌株的篩選方法及其發酵生產纖維素酶的方法進 行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此 在不脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種產纖維素酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法包括以下步驟:初篩、 原生質體制備、紫外光照誘變選育、復篩； 所述產纖維素酶菌株現在由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏編號為No . 11119，分類命名為葡枝根霉點頭變種Rhizopus stolonifer var.refiexus〇2. 根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法具體包括以下步驟： A. 初篩培養基初篩，所述初篩培養基的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖 3_5g;瓊脂 10_20g ;MandelS 無機營養鹽 lOOOmL; B. 制備原生質體，將初篩得到的菌株的孢子于PDA培養基中培養，經純化、離心后獲得 的菌絲于破壁液中振蕩孵育，過濾、離心純化后得到原生質體;所述破壁液的成分為蝸牛 酶:纖維素酶= 3:1; C. 誘變選育，將步驟B得到的原生質體用15W紫外燈照射進行誘變處理，處理液涂布于 高滲初篩培養基平板上，培養后菌落轉接到PDA斜面培養基培養； 所述高滲初篩培養基平板的成分為:每L培養基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g;瓊脂 10_20g;MandeIS無機營養鹽lOOOmL;KC1 0.6mol; D. 復篩;將步驟C得到的PDA斜面培養基上的培養物的孢子懸液接種于液態種子培養基 中培養，并將種子培養液按1:10體積比接種到液態發酵培養基中培養，過對發酵產物酶解 還原糖產量的測定，篩選出酶活性高的菌株，即為產纖維素酶菌株TP-02。3. 根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述液態種子培養基的成分為：10% 麩皮浸出汁。4. 根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述液態發酵培養基的成分為:每L培 養基含有：80~120目的玉米秸桿、稻草或麥桿5-10g，5%麩皮浸出汁80-100g，（NH4) 2S04 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4.7H20 5-10g，CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素： FeS04· 7H20 0.003-0.005g,MnS04· H2O 0.001-0.00156g,ZnS04· 7H20 0.001-0.0014g, CoCh · 6H2O 0.001_0.002g，pH 5.0。5. 根據權利要求1所述的篩選方法篩選得到的菌株作為生產維素酶的應用。6. -種維素酶的生產方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 使用液態種子培養基對根據權利要求1所述的篩選方法篩選得到的菌株TP-02進行 種子培養，得到種子培養液； (2) 將種子培養液接種到液態發酵培養基中培養，液態發酵產纖維素酶。7. 根據權利要求6所述的生產方法，其特征在于，所述步驟（1)具體包括以下步驟:對根 據權利要求1所述的篩選方法篩選得到的菌株TP-02先后經TOA斜面培養基、液態種子培養 基進行培養，并將所得種子液保存在_80°C超低溫甘油凍結管中； 將在-80°C超低溫甘油凍結管中保存的種子液先后經TOA斜面培養基、液態種子培養基 培養后即可制得種子培養液。8. 根據權利要求6所述的生產方法，其特征在于，所述步驟(2)中，種子培養液與液態發 酵培養基的體積之比為1:9~10。9. 根據權利要求6所述的生產方法，其特征在于，所述步驟（2)中的培養條件是30°C、 200~350r/min培養84~96小時。10.根據權利要求9所述的生產方法，其特征在于，所述步驟(2)中的培養條件還包括： 發酵罐中通氣量為4.5vvm，罐壓為0.03MPa，pH為5.0~5.5范圍。
【專利摘要】本發明公開了一種產纖維素酶菌株的篩選方法及其發酵生產纖維素酶的方法，所述菌株是從黃山生態林腐木中通過初篩、原生質體制備、紫外光照誘變選育、復篩得到的一種名稱為TP-02的產纖維素酶的菌株，該菌株具備高產纖維素酶的能力，可以豆粕、硫酸銨、尿素或氯化銨為氮源，以麩皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸稈或玉米秸稈為碳源經液態發酵，在培養72～84小時后，其濾紙酶活力可達到16.98IU/mL，內切酶酶活達到41.33IU/mL，外切酶酶活達到3.65IU/mL，β-葡聚糖苷酶酶活力達到15.98IU/mL。CGMCC No.1111920150716
【IPC分類】C12N13/00, C12N15/01, C12N9/42, C12R1/845
【公開號】CN105647904
【申請號】
【發明人】湯斌, 張慶慶, 湯文晶, 李松
【申請人】安徽工程大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月31日