利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于葡萄體細胞雜交技術領域，具體涉及一種利用原生質體不對稱融合技 術獲得葡萄雜種植株的方法。
【背景技術】
[0002] 植物有性雜交僅限于部分親緣關系較近的栽培種與野生種之間或種內，有些植物 的有性生殖能力很低甚至不具備，所以很難通過有性雜交的方式來改良與培育新品種，嚴 重限制了育種工作的進展。我國南方葡萄常規育種的方法包括雜交育種、引種、實生選種、 誘變育種以及芽變選種等。而植物體細胞雜交技術則可以通過異源原生質體的融合，廣泛 地重組植物界優良的遺傳性狀，克服遠緣有性雜交不親和性，縮短育種年限，擴大基因重組 范圍，為創造新型植物開辟了廣泛的應用前景，也為植物育種和創造育種材料開創了一條 全新的途徑，因而已開始應用于農作物、蔬菜、果樹、中藥材以及其他植物的品種改良，并且 獲得了種間、種內、屬間的雜種體細胞或胞質雜種。利用細胞融合技術育種是進行葡萄種質 資源創新的一條有效途徑，可以縮短葡萄的育種年限，提高育種效率，創造新的品種和類 型。有關葡萄原生質體融合方面的研究報道還很少，篩選適宜的基因型是葡萄原生質體能 否培養成功的重要因素，在葡萄原生質體培養研究中進行了大量的基因型篩選，而最后僅 有少量的基因型材料獲得再生植株，還處于摸索階段。對葡萄原生質體培養的最適條件，原 生質體鈍化的最佳劑量，原生質體融合的最佳PEG濃度、融合后雜種體細胞的培養以及植株 再生的相關適宜條件等都研究的不多，還沒有形成成熟的技術體系。
[0003] 授權公告號為CN101139582A的中國發明專利公開了一種利用原生質體不對稱融 合技術獲得香蕉體細胞雜種的方法。該方法是將香蕉胚性懸浮細胞在酶解液中進行酶解獲 得原生質體，受體原生質體用碘乙酰胺進行處理，供體原生質體用紫外燈進行照射處理，將 供體原生質體和受體原生質體混合后，用聚乙二醇法進行融合。融合產物懸浮于原生質體 液體培養基中進行看護培養，獲得的細胞團轉移到體細胞胚誘導培養基上進行培養，直至 體細胞胚萌發，再進行培養即獲得完整的體細胞雜種植株。授權公告號為CN102505004A的 中國發明專利公開了一種草莓原生質體的提取及融合的方法。該方法是以草莓的葉片為研 究材料，通過前處理和酶解相結合的方式獲得高活力的原生質體，利用30-45%PEG 6000結 合高Ca2+，高pH的方法誘導兩者融合，提高了原生質體一對一融合的概率，分離的原生質體 活力在85%以上，一對一融合率最高可達到11.7%。授權公告號為0附04429939六的中國發 明專利公開了一種利用二倍體細胞與花粉細胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法。
[0004] 葡萄較其他果樹在原生質體培養以及植株再生技術方面的研究進展緩慢，而且是 被公認的難于進行植株再生和遺傳轉化的果樹品種之一。有關葡萄原生質體分離純化、培 養以及融合方面存在極少成功范例。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服以上現有技術問題的不足，提供一種利用原生 質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法。該方法以葡萄胚性愈傷組織為材料，對原 生質體的分離純化、原生質體的培養、原生質體的融合、雜種細胞的選擇、雜種細胞的培養 等進行研究。本發明初步建立起了葡萄原生質體的培養和融合技術體系，為培育葡萄新品 種、增強葡萄的抗性、提高葡萄品質奠定了基礎，具有十分重要的理論和實際應用價值。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：
[0007] -種利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，包括以下操作步 驟：
[0008] (1)原生質體的分離和純化:取新鮮的胚性愈傷組織加酶液，在26-28Γ、黑暗條件 下，60-70r/min振蕩酶解2-12h，然后分離純化得到葡萄原生質體；
[0009] (2)原生質體的的鈍化處理：
[0010] (a) Ι0Α鈍化:取步驟（1)獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體密度 為0.5-1 X 105個/mL的懸浮液，然后加入1:5配比（體積比）的4.0-8. Ommol/L碘乙酰胺（Ι0Α) 溶液鈍化處理9-1 lmin，處理完后使用CPW溶液洗滌2-3遍，用KMsP液體培養基懸浮，將原生 質體密度調整為0.5-1 X105個/mL，得到受體原生質體；
[0011] (b)UV鈍化:取步驟（1)獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體密度為 0.5-1 X 105個/mL的懸浮液，在1250-1350yW/cm2紫外光照強度下照射0.5-16min，得到供體 原生質體；
[0012] (3)原生質體的融合:將步驟(3)(a)得到的受體原生質體和步驟(3)(b)得到的供 體原生質體按1:1體積比混合，得親本懸浮液，加入1-4倍親本懸浮液體積的PEG融合誘導 液，在25-30 °C下保溫15-30min，再加入2-4倍親本懸浮液體積的高Ca2+-高pH溶液，混合后在 25-30°C下保溫10_15min，然后使用CPW溶液洗滌2-3遍，離心得到融合的雜種細胞；
[0013] (4)融合體細胞的培養:使用KMsP固體培養基包埋培養步驟(3)得到的融合雜種細 胞，在25-27 °C、黑暗條件下靜置培養，直至長出再生胚性愈傷組織顆粒；
[0014] (5)再生胚性愈傷組織胚狀體的誘導：將再生胚性愈傷組織顆粒轉接至分化培養 基上誘導胚狀體，直至長出不定芽，再將不定芽轉接到生根培養基上培養；
[0015] (6)煉苗與移栽：當組培苗長到5-7cm、且根系生長旺盛時，將組培苗移栽入煉苗室 中進行煉苗，即得到體細胞雜種植株。
[0016] 所述步驟⑴中酶液的配方為：2.50 % (g/100mL，下同）纖維素酶、0.25 %果膠酶、 0.75 %離析酶、0.40mo 1/L甘露醇、0.1 %MES(2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸），pH 5.8。
[0017 ]所述步驟(1)中每1 g胚性愈傷組織加酶液的量為1 〇mL。
[0018] 所述步驟(3)中PEG融合誘導液的配方為：以CPW溶液為基液，每100mL 中含PEG30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4lOmg、甘露醇3g。
[0019] 所述步驟(3)中高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-NaOH緩沖液和Ca (N〇3) 2溶液等量混合 而成。其中所述甘氨酸-NaOH緩沖液的配方為：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并使用 0 · 2mol/LNa0H 溶液調 pH 至 9-10.5;所述 Ca(N03)2 溶液的濃度為 94 · 4g/L。
[0020] 所述步驟（5)中分化培養基的配方為含6-芐氨基腺嘌呤0.1mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L的MS培養基，pH 5.8。
[0021] 所述步驟（5)中生根培養基的配方為含萘乙酸（NAA)1.0mg/L、吲哚丁酸（IBA) 0.5mg/L-1 的1/2MS培養基，pH 5.8。
[0022] 所述CPW溶液的配方為：磷酸二氫鉀(KH2P〇4)27.2mg/L、硝酸鉀(KN0 3)101.0mg/L、 二水合氯化鈣（CaCl2 · 2H20) 1480.Omg/L、七水合硫酸鎂(MgS〇4 · 7H20)246.0mg/L、碘化鉀 (1(1)0.1611^/1、五水合硫酸銅（(：113〇4,5!1 20)0.0251^/1。
[0023] 原生質體從分離純化、培養、胚狀體誘導以及到再生植株的過程極其漫長復雜，這 一過程中的各個步驟對原生質體的培養及植株再生都有著決定性的作用。合適的基因型、 原生質體的分離材料、滲透壓穩定劑的濃度、酶解時間、離心轉速和時間、培養溫度以及pH 值等都對植株再生有一定的影響，以上這些影響因素在原生質體的培養過程中影響也較 大。
[0024]與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：
[0025] (1)以葡萄胚性愈傷組織分離的原生質體為材料，比葉片、莖段、普通愈傷組織等 分離的材料分化能力更強，更易獲得再生植株，且取材方便，不受時間、季節等氣候條件的 限制，可根據需要隨時進行葡萄胚性愈傷組織的誘導培養；
[0026] (2)采用的原生質體培養基為KMsP培養基，比MS、B5、D2以及CPW-13M等培養基的Ca 2+ 濃度高，NH4+濃度低，碳源豐富，原生質體生長所需的各種營養物質豐富，如維生素、水解酪 蛋白、微量元素等，因此，取得了較好的培養效果；
[0027] (3)受體和供體原生質體在融合前分別進行鈍化處理，可達到只有融合產物才能 夠再生植株，因此所獲得的再生植株絕大多數為雜種，可減少培養過程的工作量及后期對 雜種的篩選和鑒定工作；
[0028] (4)原生質體融合采用的是不對稱的融合方式，所獲得的雜種植株為不對稱雜種；
[0029] (5)本發明步驟簡單，耗時短，對設備和培養條件的要求較低，有效地解決了葡萄 原生質體培養及融合困難的問題，為建立起葡萄原生質體分離純化、培養以及融合的成熟 技術體系提供了一定的理論依據和技術支持。
【附圖說明】
[0030] 圖1所示的是本發明胚性愈傷組織分離的原生質體照片；
[0031] 圖2所示的是本發明葡萄原生質體融合的照片；
[0032] 圖3所示的是本發明葡萄原生質體培養的照片；
[0033] 圖4所示的是本發明葡萄胚性愈傷組織體細胞胚的照片；
[0034] 圖5所示的是本發明葡萄原生質體經融合獲得的雜種植株照片；
[0035] 圖6所示的是本發明葡萄雜種植株生根煉苗的照