片。
【具體實施方式】
[0036]以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語 具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。
[0037]本實施例利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，包括以下步 驟：
[0038] 1.葡萄原生質體的分離和純化
[0039]原生質體的分離是原生質體培養成功的一個重要環節，原生質體的酶解不僅受到 分離材料的影響，而且還與酶的種類和濃度、酶解時間、溫度、pH、滲透壓及其他因素有關。 如表1、表2列出不同的纖維素酶、果膠酶、離析酶、甘露醇及酶解時間對原生質體分離數量 和活力的影響。
[0040]本發明將預做原生質體分離的新鮮的胚性愈傷組織置于黑暗中培養24h，取lg愈 傷組織加10mL酶液，27±1°C、黑暗條件下60-70r · min-S振蕩酶解2-12h。在原生質體酶解 過程中，從酶解后2h開始取樣，之后每隔2h再取樣1次放于倒置顯微鏡下觀察原生質體酶解 情況并計數，至原生質體數比前一次所計個數不再增加時停止酶解。
[0041 ]酶解結束后，在超凈工作臺上把混合液依次通過200目和400目不銹鋼細胞篩，去 除未酶解徹底的組織，用l_2mL的CPW溶液洗滌網，收集濾液置于15mL無菌離心管中，在 700r · mirT1下離心8min，使原生質體沉降。離心結束后棄去上層酶液及微小細胞殘片，剩余 l-2mL左右的沉淀，用移液槍吸取10mL CPW溶液沿離心管壁緩慢加入懸浮管底的原生質體。 懸浮液700r · mirT1離心8min.，棄去上清液，再用CPW溶液洗滌1-2次。沉淀重懸于l-2mL原生 質體洗滌液后鋪層于15mL無菌離心管內5mLCPW-23S鹿糖液層上，500r · min-1離心5min，輕 輕吸取0與CPW23S蔗糖界面的原生質體，轉至15mL無菌離心管中5mL洗滌液內，在700r · min-1下離心8min，去除上清液，再用CPW溶液洗滌2-3次。最后，再加入CPW溶液，制成原生質 體懸浮液，再根據需要調節密度（1〇 5-1〇6左右)后備用。
[0042]表1各因素對葡萄原生質體分離數量的影響
[0043]
[0044] 由表1可以看出，不同的組合對原生質體酶解數量的影響不一樣，以10號組合的效 果最好，原生質體的產量達12.33X 105個?ml/1。由極差分析可以得出，不同處理組合對葡 萄原生質體的酶解數量影響差異顯著。各因素水平對原生質體酶解數量影響的大小順序 為:R(果膠酶濃度)>R(纖維素酶濃度)>R(甘露醇濃度)>R(酶解時間）>R(離析酶濃度），說明 5個因素中果膠酶濃度對原生質體酶解數量影響最大，其次是纖維素酶濃度、甘露醇濃度、 酶解時間和離析酶濃度。各因素的最優水平分別是甘露醇濃度第一水平，酶解時間第二水 平，果膠酶濃度和離析酶濃度第三水平，纖維素酶濃度第四水平。
[0045]表2各影響因素對葡萄原生質體分離活力的影響
[0046]
[0047] 由表2可以看出，不同的試驗組合對葡萄原生質體活力的影響不一樣。以3號組合 的效果最好，原生質體的活力最高為76%。由極差分析可以得出，不同處理組合對葡萄原生 質體活力的影響差異顯著。各因素水平對原生質體活力影響的大小順序為:R(酶解時間）>R (離析酶濃度)>R(甘露醇濃度)>R(果膠酶濃度)>R(纖維素酶濃度），說明5個因素中酶解時 間對原生質體活力影響最大，其次是離析酶濃度、甘露醇濃度、果膠酶濃度，最后是纖維素 酶濃度。各因素的最優水平分別是甘露醇濃度第一水平，酶解時間第三水平，纖維素酶濃度 第一水平，果膠酶濃度第一水平和離析酶濃度第一水平。
[0048]結合以上數據和分析，最終確定本發明酶液配方如下：2.50%纖維素酶、0.25%果 膠酶、0.25 %離析酶、0.40mo 1/L甘露醇、0.1 %MES，pH 5.8。酶解時間最佳為6h。
[0049] 本發明胚性愈傷組織分離的原生質體照片如圖1所示。
[0050] 2.葡萄原生質體的Ι0Α和UV鈍化處理
[0051] (1)碘乙酰胺（Ι0Α)能夠破壞細胞質中的細胞器，導致細胞質失活。Ι0Α溶于KM8P液 體培養基中，試驗設置5個濃度梯度（1，2，4，8，16mmo 1 · L-1)，pH值均調至5 · 8，溶液經0 · 45um 微孔濾膜過濾滅菌后放于4°C冰箱備用。將醉金香葡萄原生質體分別用不同濃度的Ι0Α黑暗 4°C條件下靜置鈍化處理lOmin，使其細胞質失活，夏黑葡萄原生質體不做處理。或者夏黑原 生質體鈍化處理而醉金香原生質體不做處理。處理后的原生質體700r · mirT1離心5min，離 心后棄上清液，用CPW溶液洗2-3遍后，加 KMsP培養基洗滌一次，最后將鈍化后的原生質體用 KMsP液體培養基懸浮，原生質體密度調整為1 X 105個· ml/1備用。取1滴原生質體懸浮液于 載玻片上測定其活力，其余轉入小培養皿(直徑6cm)中。以KMsP為基本培養基，27 ± 1°C黑暗 條件下進行低熔點瓊脂糖固體包埋培養，以不做鈍化處理的為對照。每隔2d放置于倒置顯 微鏡下觀察其形態及分裂情況。
[0052]表3不同Ι0Α濃度對醉金香原生質體的影響
[0053]
[0054]從表3可知，不同濃度的Ι0Α處理對醉金香原生質體活力的鈍化作用差異顯著。經 1.0,2.0,4.0,8. Ommo 1 · I/110Α處理后，醉金香原生質體活力分別比對照下降了 33.8 %， 52.2%，74.96%和76%，表明醉金香原生質體對Ι0Α十分敏感。隨著Ι0Α濃度的增加，原生質 體細胞的破碎程度呈加大趨勢。經4.0mmol · I^IOA處理后99%左右的醉金香原生質體都被 滅活且細胞破碎程度不是很高。說明4.Ommol · I^IOA能有效鈍化醉金香葡萄的原生質體。
[0055] (2)夏黑葡萄的胚性愈傷組織經分離純化后，將其原生質體密度調成IX 105個· ml/1，分別吸取lmL夏黑原生質體于無菌塑料小培養皿(直徑3cm)中，使其剛好鋪成一層并做 好記，將小培養皿放入紫外線燈箱（有2根15W紫外燈，箱底距紫外燈管25cm)中連續照射 0· 5min，lmin，2min，4min，6min，8min，16min，每個處理5皿，重復3次。照射后分別取1滴原生 質體懸浮液于載玻片上測定其活力，其余轉入小培養皿（直徑6cm)中。以KMsP為基本培養 基，27±1°C黑暗下進行低熔點瓊脂糖固體包埋培養，以不做鈍化處理為對照。每隔2d放置 于倒置顯微鏡下觀察其形態及分裂情況。
[0056] 表4不同UV處理時間對夏黑原生質體的影響
[0057]
[0058]從表4可以看出，不同濃度的UV處理對夏黑葡萄原生質體活力的鈍化作用差異顯 著。經Ο · 5min，lmin，2min，4min，6min，8min，16min UV處理后，夏黑原生質體活力分別比對 照下降了 18.5%，33.9%，51.9%、59.5%、65.5%，70.8%和76%。隨著群照射時間的延長， UV對夏黑原生質體活力的鈍化作用增強，且細胞破碎程度加深。其中8min UV照射處理原生 質體的細胞破碎程度開始增大，如再延長處理時間會增強原生質體的鈍化，出現更多的原 生質體細胞死亡、破碎。因此，UV照射8min能有效鈍化夏黑葡萄的原生質體。
[0059]將Ι0Α(醉金香)和UV(夏黑）鈍化處理后的原生質體按體積比1:1在離心管中混合 備用。
[0060] 3.葡萄原生質體的融合
[0061]本發明采用PEG-高pH-高Ca2+法誘導葡萄原生質體的融合，影響PEG融合的因素主 要有PEG的種類、分子量、處理時間、濃度、原生質體的密度以及生理狀態等。PEG融合法所需 設備簡單，操作簡單，處理量大，沒有明顯的融合特異性。PEG融合法的不足之處在于處理時 間較長，操作過程比較復雜，對原生質體融合時所需的密度較大，而且對原生質體的傷害也 較大。因此，試驗過程中要嚴格控制各因素對原生質體融合的影響。
[0062] 本發明將PEG的濃度設置為20 %，30 %，40 %，50%。用小試管進行融合處理時，取 混合好的兩親本原生質體懸浮液0.5-lmL，吸取l-2mL的PEG融合誘導液沿小試管壁緩慢加 入，同時轉動小試管，使PEG溶液與原生質體充分接觸，促使原生質體相互粘連。此過程在 25-30°C下約需15-30min，鏡檢可以看到兩親本原生質體聚集粘連。保溫后，用同樣的方法 加入約2mL的高Ca 2+-高pH溶液，混合后保溫約10-15min。
[0063] 表5PEG濃度對細胞融合的影響
[0064]
[0065]從表5可知，隨著PEG濃度的增加，異源融合率呈先上升后下降的變化，其中PEG濃 度為40%時，融合率最大，為7.8%，但高于40%以后，融合率下降。但當PEG濃度為50 %時， 融合產物不能存活，大量的原生質體破碎，逐漸死亡。由于PEG本身對原生質體具有一定的 毒性，為減少其對融合產物生長發育的副作用，選擇40%的PEG濃度作為醉金香和夏黑原生 質體融合的適宜濃度，此時多數原生質體呈一對一融合，異源融合率為7.8%。
[0066]根據以上試驗，最終確定本發明PEG融合誘導液的配方為：以CPW溶液為基液，每 100mL中含PEG 30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4lOmg、甘露醇3g。
[0067] 高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-