NaOH緩沖液和Ca(N03) 2溶液等量混合而成，其中甘氨 酸-NaOH緩沖液的配方為:甘氨酸3 · 75g/L、甘露醇15g/L，并使用0 · 2mol/LNa0H溶液調pH至 9-10 · 5; Ca(N03)2溶液的濃度為 94 · 4g/L。
[0068] 本發明葡萄原生質體融合的照片如圖2所示。
[0069] 4.融合體細胞的培養
[0070] 將融合后的雜種細胞，加入KMsP液體培養基調節密度至1 X 105個· ml/1，以KMsP為 基本培養基，采用低熔點瓊脂糖固體包埋的方法培養原生質體，封口膜封口后在培養箱中 25°C恒溫暗培養。由胚性愈傷組織分離的原生質體在KM 8P培養基上6-7d左右原生質體復 壁，14-15d左右出現第一次分裂，20-25d出現第二次分裂，65-70d左右出現肉眼可見小愈傷 組織。葡萄原生質體培養的照片如圖3所示。
[0071 ] 5.再生胚性愈傷組織胚狀體的誘導
[0072] 逐步、即時將再生胚性愈傷組織顆粒轉接至分化培養基MS+6-BA 0. lmg · L-bNAA 0. lmg · Γ1上誘導胚狀體，在25°C下暗培養2周后移置光照強度為1000-15001x下培養，照光 1周后生出不定芽，再將不定芽轉接到生根培養基1/2MS+NAA l.Omg.L-blBA 0.5mg.L一1 上培養。葡萄胚性愈傷組織體細胞胚的照片如圖4所示。
[0073] 6.煉苗與移栽
[0074]當組培苗長到5~7cm，且根系生長旺盛時，將組培苗放在煉苗室中進行煉苗6~ 9d，開瓶煉苗分階段進行，即首先松蓋2~3d，然后部分開蓋2~3d，最后完全揭去蓋。逐步使 試管苗適應溫室環境，以防止葉片萎蔫。用鑷子輕輕將試管苗從瓶中取出，放在水中徹底清 除根部的培養基，然后用〇. 1%的多菌靈浸泡根部10~30min后，移入經滅菌后的基質中。移 栽后澆透水，噴施除去有機物的1/2MS營養液，并附上塑料膜保持相對濕度。在移入基質后 的第5d、10d、15d、20d去掉附上的塑膠膜進行敞開煉苗，并在相同條件下取小苗的葉片，觀 察葉片的氣孔大小。移栽前期用除去有機物的1/2MS對小苗進行噴霧，當小苗莖桿顏色加 深，葉片油亮時或長出新葉后用自來水澆灌。葡萄原生質體經融合獲得的雜種植株照片如 圖5所示。煉苗過程見圖6。
[0075] 本發明實施例涉及的CPW溶液配方:磷酸二氫鉀27.2mg/L、硝酸鉀101.0mg/L、二水 合氯化1丐1480 · Omg/L、七水合硫酸鎂246 · Omg/L、碘化鉀0 · 16mg/L、五水合硫酸銅0 · 025mg/ L〇
[0076]本發明實施例涉及到的主要培養基如表6所示；所使用的主要試劑有a-萘乙酸 (NAA)、6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸（IBA)、鹽酸(HCL)、氫氧化鈉(NaOH)、瓊脂、無水乙 醇、甘露醇、甘露醇、磷酸二氫鉀(KH 2P〇4)、硝酸鉀、二水氯化鈣、七水硫酸鎂、碘化鉀、五水硫 酸銅、蔗糖、硼酸、肌醇、葉酸、檸檬酸、蘋果酸、生物素、水解酪蛋白、纖維素酶(Cellulase)、 離析酶(Macerozyme)、果膠酶(Pectolyase)、2-(N_嗎啡啉）乙磺酸、低恪點瓊脂糖、聚乙二 醇6000(PEG)、甘氨酸、Ca(N0 3)2 · 4H20、碘乙酰胺（Ι0Α)等;所使用的主要儀器有高壓蒸汽滅 菌鍋、雷磁Phs-3c精密pH計、電子分析天平、超凈工作臺、微量移液器(Eppendorf)、人工氣 候箱、水浴冷凍恒溫振蕩器(LSHE-300D)、普通光學顯微鏡(OLYMPUS Dp70.)、倒置顯微鏡 (Nikon MODEL C-LEDS)、熒光倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti-S)、血球計數板、細胞篩、低 速離心機(TDL-40B)等;其他用到的材料、試劑和實驗設備，如無特別說明，均為符合原生質 體不對稱融合技術領域的市售產品。
[0077]以上所述，僅為本發明的優選實施例，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明的核心技術的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 屬于本發明的專利保護范圍。與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都 應認為是包括在權利要求書的范圍內。
[0078] 表6MS和KMsP培養基配方(mg/L)
【主權項】
1. 一種利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其特征在于包括以下 操作步驟： (1) 原生質體的分離和純化:取新鮮的胚性愈傷組織加酶液，在26-28Γ、黑暗條件下， 60-70r/min振蕩酶解2-12h，然后分離純化得到葡萄原生質體； (2) 原生質體的的鈍化處理： (a) IOA鈍化：取步驟（1)獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體密度為 0.5-1 X 105個/mL的懸浮液，然后加入1:5配比的4.0-8. Ommol/L碘乙酰胺溶液鈍化處理9-llmin，處理完后使用CPW溶液洗滌2-3遍，用KMsP液體培養基懸浮，將原生質體密度調整為 0.5-1 X 105個/mL，得到受體原生質體； (b) UV鈍化:取步驟（1)獲得的原生質體使用CPW溶液懸浮，調整到原生質體密度為0.5-1X105個/mL的懸浮液，在1250-1350yW/cm 2紫外光照強度下照射0.5-16min，得到供體原生 質體； (3) 原生質體的融合:將步驟(3)(a)得到的受體原生質體和步驟(3)(b)得到的供體原 生質體按1:1體積比混合，得親本懸浮液，加入1-4倍親本懸浮液體積的PEG融合誘導液，在 25-30°C下保溫15-30min，再加入2-4倍親本懸浮液體積的高Ca 2+-高pH溶液，混合后在25-30 °C下保溫10_15min，然后使用CPW溶液洗滌2-3遍，離心得到融合的雜種細胞； (4) 融合體細胞的培養:使用KMsP固體培養基包埋培養步驟(3)得到的融合雜種細胞，在 25-27Γ、黑暗條件下靜置培養，直至長出再生胚性愈傷組織顆粒； (5) 再生胚性愈傷組織胚狀體的誘導：將再生胚性愈傷組織顆粒轉接至分化培養基上 誘導胚狀體，直至長出不定芽，再將不定芽轉接到生根培養基上培養； (6) 煉苗與移栽：當組培苗長到5-7cm、且根系生長旺盛時，將組培苗移栽入煉苗室中進 行煉苗，即得到體細胞雜種植株。2. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述步驟（1)中酶液的配方為：2.50 %纖維素酶、0.25 %果膠酶、0.25 %離析酶、 0.40mol/L甘露醇、0.1%MES，pH 5.8。3. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述步驟(1)中每lg胚性愈傷組織加酶液的量為10mL。4. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于：所述步驟（3)中PEG融合誘導液的配方為：以CPW溶液為基液，每100mL中含PEG 30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4 10mg、甘露醇3g。5. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述步驟(3)中高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-NaOH緩沖液和Ca (N〇3) 2溶液等量混合 而成。6. 根據權利要求5所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于：所述甘氨酸-NaOH緩沖液的配方為：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并使用 0 · 2mol/LNaOH 溶液調 pH 至 9-10 · 5。7. 根據權利要求5所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述Ca (N〇3) 2溶液的濃度為94.4g/L。8. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述步驟(5)中分化培養基的配方為含6-芐氨基腺嘌呤O.lmg/L、萘乙酸O.lmg/L 的MS培養基，pH 5.8。9. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述步驟(5)中生根培養基的配方為含萘乙酸1.0mg/L、吲哚丁酸OAmg/I/ 1的1/ 2MS培養基，pH 5.8。10. 根據權利要求1所述的利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，其 特征在于:所述CPW溶液的配方為:磷酸二氫鉀27.2mg/L、硝酸鉀101.0mg/L、二水合氯化鈣 1480.0 mg/L、七水合硫酸鎂246. Omg/L、碘化鉀0.16mg/L、五水合硫酸銅0.025mg/L。
【專利摘要】本發明提供一種利用原生質體不對稱融合技術獲得葡萄雜種植株的方法，包括以下步驟：取新鮮的胚性愈傷組織加酶液酶解；原生質體分別進行IOA鈍化和UV鈍化，得受體原生質體和供體原生質體按1︰1混合，依次加入PEG融合誘導液、高Ca2+-高pH溶液，獲得融合的雜種細胞；使用KM8P固體培養基包埋培養融合雜種細胞；將再生胚性愈傷組織顆粒依次轉接至分化培養基、生根培養基上培養；當組培苗長到5-7cm栽入煉苗室中煉苗，得到體細胞雜種植株。該方法以葡萄胚性愈傷組織為材料，利用原生質體不對稱融合技術成功獲得獲得葡萄雜種植株，為培育葡萄新品種、增強葡萄的抗性、提高葡萄品質奠定了基礎。
【IPC分類】A01H4/00, A01H5/00, C12N15/05
【公開號】CN105647905
【申請號】
【發明人】吳月燕, 饒慧云, 錢萍仙, 劉蓉, 盧丹
【申請人】浙江萬里學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月30日